薄皮甜瓜采后病害生防菌株的筛选及鉴定

曹旭　陈静宇　张淑梅等

摘要[目的]从薄皮甜瓜体表分离筛选对引起薄皮甜瓜采后病害主要病原真菌具有拮抗作用的生防菌株，并对其进行鉴定确定分类地位，为薄皮甜瓜采后病害的防治提供高效菌株。[方法]采用活体生测的方法从甜瓜瓜表筛选生防菌株，利用非寄养非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒（比色法）API 20 NE自动鉴定系统测定菌株C3的生理生化指标。[结果]从甜瓜表面分离筛选出2株对粉红单端孢（Trichothecium roseum）防治效果达80%以上的生防菌株C3、B3；通过平板对峙试验表明，菌株C3对引起采后病害的2种病原菌粉红单端孢（Trichothecium roseum）和镰刀菌（Fusarium spp. ）的抑菌能力均优于B3； 菌株C3对粉红单端孢（Trichothecium roseum） 的抑菌效果较好，达到67.7%；对镰刀菌（Fusarium spp. ）的抑菌率次之，为27.9%；应用API 20 NE系统分析， 通过形态学观察、革兰氏染色将菌株C3初步鉴定为浅黄假单胞菌Pseudomonas luteola。[结论]从甜瓜表面分离筛选获得1株生防菌株C3，该菌株对引起薄皮甜瓜采摘后病害的主要病原菌粉红单端孢（Trichothecium roseum）具有较强的拮抗作用，并初步鉴定为浅黄假单胞菌（Pseudomonas luteola）。

关键词甜瓜；采后病害；生防菌；筛选

中图分类号S436.42文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03552-03

作者简介曹旭（1988-），女，黑龙江哈尔滨人，研究实习员，在读硕士，从事农业微生物、生物防治研究方面。*通讯作者，研究员，博士，硕士生导师，从事农业微生物、生物防治研究。

薄皮甜瓜（Cucumis melo var. makuwa Makino），因其果实甘甜，清爽芳香，风味独特，营养丰富，而倍受人们青睐。统计显示，我国新疆、甘肃、陕西、内蒙古等地区都有大量的甜瓜种植，栽培面积和产量均居世界第一位[1]。“十五”期间我国甜瓜种植面积约533万hm2，但随着甜瓜的大面积集中种植，成熟期也相对集中，再加上其不耐储运的特点，采后病害发生相当严重。从而使甜瓜不能远距离外销，即使外销，也多是未成熟瓜，失去了应有的风味，大大降低了其食用价值和经济价值。因而采后病害成为目前制约甜瓜经济效益的主要障碍。据估计，采后病害造成的损失高达35%～50%[2-5]。研究表明，造成甜瓜采后腐烂变质的主要原因是由于多种病原菌的侵染[6-7]，其中粉红单端孢（Trichothecium roseum）和镰刀菌（Fusarium spp.）分别引起的粉霉病和白霉病是甜瓜采后发生的主要病害[8]。

目前，在甜瓜采后病害的众多防治方法中，化学药剂使用最广泛，虽然防治效果显著，但存在抗药性和残留问题[9]。且农药残留对人体健康和环境的潜在危害，已成为全社会关心的问题。自20世纪80年代以来，生物防治作为一种控制果蔬采后病害的新途径逐渐被人们接受、重视，并成为研究的热点。由于生物防腐不具有化学防腐保鲜带来的环境污染、农药残留及连续使用产生抗药性等缺点而将逐步取代化学杀菌剂，成为一种新的保鲜方法[10-13]。生物防治应用于采后病害的防治，已取得了令人鼓舞的成绩。现已证明拮抗细菌Pseudomonas sp.和Bacillus sp.对柑橘采后病害有很好的防治效果。美国等已有利用拮抗菌防治核果类、仁果类、柑橘及一些蔬菜采后病害的成功先例。而我国在采后病害的生物防治方面研究较少，尤其是利用生防菌防治甜瓜采后病害方面的研究更少，为此，笔者通过从甜瓜表面分离筛选出生防菌株，并利用非寄养非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒（比色法）API 20 NE自动鉴定系统对分离筛选出的菌株进行初步鉴定。

1 材料与方法

1.1材料样品：哈尔滨市果蔬批发市场购买的大小均一、成熟度一致、无病无伤的薄皮甜瓜若干。

菌株：粉红单端孢菌（Trichothecium roseum）、镰刀菌（Fusarium spp.）均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。

试剂：EDTA、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、去离子水等试剂均为分析纯；非寄养非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒（比色法）API 20 NE购自法国梅里埃公司。

培养基：PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 ml）；NYD培养基（牛肉浸膏8 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 ml）。

1.2生防菌的分离

1.2.1生防菌的初步筛选。用2 L 0.2 mol/L磷酸缓冲液分批次洗涤30个健康甜瓜的表面，将洗涤液透析浓缩至100 ml保存待用。 以粉红单端孢为靶标病原菌，接种在PDA培养基于28 ℃温箱中进行培养，当菌丝长满培养皿且有大量孢子产生时，用无菌水洗脱，配成浓度1×105个/ml的孢子悬浮液。将薄皮甜瓜表面进行消毒，用无菌水清洗后晾干，在瓜表面用手术刀划出8个3.0 cm×0.5 cm大小的伤口，每瓜上均设1个健康对照（只接无菌水），1个感病对照（只接种粉红单端孢孢子悬浮液），6个洗涤液处理（先接100 μl浓缩液，待风干后接种20 μl粉红单端孢孢子悬浮液），静置30 min，装于PVC袋中室温保存，4 d后观察甜瓜发病情况。

选取未发病或发病较轻的处理，将该批次的浓缩液进行梯度稀释涂布于NYDA培养基上，置于32 ℃培养箱内培养18 h，挑选不同菌落形态的菌株进行标号并分离培养；分离出的单个菌落接入装有NYD培养基（5 ml）的试管中，于32 ℃、150 r/min培养18 h，以粉红单端孢为靶标病原菌进行生测待用。

1.2.2生防菌的復筛。将初筛所得菌株以粉红单端孢为靶标病原菌，参照“1.2.1”方法在瓜上进行复筛，每个处理重复4次，每个甜瓜均设1个病原对照、1个空白对照、6个不同待测菌株，观察甜瓜发病情况，测量病斑直径，计算防治效果。筛选具有较好生防效果（防治效果大于80%）的生防菌，进行纯化并保藏。

防治效果（%）=（对照病斑平均直径-处理病斑平均直径）/对照病斑平均直径×100。

1.3生防菌的拮抗作用测定分别以粉红单端孢和镰刀菌为靶标对象，检测具有生防效果的生防菌株的拮抗能力。在PDA平板培养基上划十字线分出4个区域，每个区域中心分别接入直径8 mm的靶标病原菌菌饼，同时在平板十字线上划入待测生防菌液，设无生防菌液为对照，重复3次。于25 ℃培养，当对照真菌长至十字线位置时观察处理组抑菌效果，测量抑菌带宽。

抑菌率（%）=（对照菌丝直径-处理菌丝直径）/对照菌丝直径×100。

1.4生防细菌的理化鉴定观察所筛目标生防菌株在NYDA平板培养基上的单菌落特征，以及在显微镜下的菌体形态[7]。参照《微生物学实验技术》[14]，对目标菌株分别进行革兰氏染色、氧化酶试验、接触酶试验。将生防菌株C3的单菌落接种于NYD 平板培养基中，32 ℃培养18 h，利用非寄养非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒（比色法）API 20 NE自动系统鉴定系统，按说明方法进行鉴定，并按文献[14]所述测定生理生化方法进行补充鉴定，观察结果。

2 结果与分析

2.1生防菌的分离筛选由表1可知，从甜瓜表面附着的微生物中初步分离出44株菌株，将这些菌株在甜瓜上进行重复筛选，筛选得到24株对粉红单端孢具有防治效果的菌株，其中2株生防菌株具有较好的防治效果，防治效果大于80%。

2.2菌株C3、B3对粉红单端孢、镰刀菌的抑菌效果通过平板对峙法，在PDA培养基上测定生防菌株C3、B3对粉红单端孢和镰刀菌均有一定的抑菌效果，其中菌株C3对2种靶标病原菌抑菌能力均优于菌株B3；菌株C3对粉红单端孢的抑菌效果较好，抑菌率可达67.7%；对镰刀菌的抑菌率次之，为27.9%（图1）。

注：a.镰刀菌对照；b.C3对镰刀菌的抑菌效果；c.粉红单端孢对照；d.C3对粉红单端孢的抑菌效果。

2.3菌株C3 的生理生化特征介于菌株C3革兰氏染色、氧化酶试验、接触酶试验均为阴性，符合非寄养非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒（比色法）API 20 NE的鉴定标准，因此利用API 20NE试剂盒鉴定菌株 C3的生理生化反应。

从表2可以看出，培养物革兰氏染色试验呈阴性，接触还原硝酸盐、葡萄糖产酸、精氨酸水解酶、β葡萄糖甙酶、β半乳糖苷酶、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄糖酸盐、苹果酸、柠檬酸、苯乙酸呈阳性，接触吲哚产生、尿素酶、明胶液化、癸酸、已二酸、氧化酶、接触酶呈阴性。

根据菌株C3的 API 20NE系统的判读结果进行比对，C3与Pseudomonas的生理生化指标较相近，菌株C3可初步鉴定为浅黄假单孢菌Pseudomonas luteola，鉴定结果可信度为96.8%。

3结论与讨论

生防菌株C3是以甜瓜采后病原菌粉红单端孢为靶标菌，以室内生测的方法分离得到。经过初筛、复筛及反复的对峙试验表明，菌株C3的防治效果较好，可达88.5%，且对引起甜瓜主要采后病害的病原菌粉红单端孢和镰刀菌具有较好的抑菌效果，分别可达67.7%和27.9%。这表明菌株C3在防治效果及抑菌能力方面都是一株具有潜力的生防菌。

通过形态学观察、革兰氏染色、结合API 20NE系统细菌生理生化特性测定，初步确定了其分类地位，将生防细菌C3鉴定为浅黄假单孢菌Pseudomonas luteola。在选择鉴定方法时，参考一些微生物鉴定试剂盒，但发现依据API 20NE系统可以将菌株鉴定到属，但由于假单胞菌属下种间遗传距离非常近，此方法不足以将菌株的分类地位确定到种的水平，为了使鉴定结果更加可信，需与分子生物学手段相结合协同16S rDNA序列分析才能较为准确地鉴定出分类地位。

近年来，诸多研究者从果蔬表面分离自然生长的微生物[15]，该研究也采用这种方式从健康的甜瓜表面分离得到生防菌C3，该菌株来源于甜瓜表面，且对引起甜瓜主要采后病害的病原菌粉红单端孢（Trichothecium roseum）和镰刀菌（Fusarium spp.）具有较好的抑菌能力和较高的防治效果。该研究只对所筛选菌株C3做了初步鉴定，而在定殖能力、生防能力及安全性的评价等方面仍需要做更深入的探索。

参考文献

[1] 陈雷，秦智伟.甜瓜采后生理和贮藏保鲜研究进展[J].北方园艺，1999（6）：24-27.

[2] 刘君璞，许勇，孙小武，等.我国西瓜甜瓜产业“十一五”的展望及建议[J].中国瓜菜，2006（1）：1-3.

[3] 马跃.中国西甜瓜业21世纪进入WTO后的发展分析[J].中国西瓜甜瓜，2000（4）：38-40.

[4] 胡俊，刘双平，黄俊霞，等.越冬病残体中哈密瓜细菌性果斑病菌存活力的研究[C]//中国植物病理学会2006年学术年会论文集.北京： 中国农业科技出版社，2006：125.

[5] 陈年来，安力.甘肃厚皮甜瓜稳定发展之策略[J].甘肃农业大学学报，1998，33（4）：12-13.

[6] 唐文华，陈策，王伟，等.厚皮甜瓜采后病害的发生及生物防治[J].中国微生态学杂志，1998（10）：65-67.

[7] WANG W，TANG W H ，HANG Y，et al.Investigation and biological contro1 of postharvest diseases of muskmelon[A].Quality assurance in agriculture produce[M].Camberra： ACIAR Proceedings，2000.

[8] 葛永红.“银帝” 甜瓜主要采后病害的潜伏侵染及抗病性诱导[D].兰州： 甘肃农业大学，2004.

[9] HUANG Y，DEVERALL B J，TANG W H，et al.Foliar application of acibenzolarSmethyl and protection of postharvest rock melons and Hami melons from disease[J].European Journal of Plant Pathology，2000，106（7）：651-656.

[10] WISNIEWSKI M E，WILSON C L.Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables recent advance[J].Hort Science，1992，27：94-98.

[11] SPADARO D，GULLINO M L.State of the art and future prospects of the biological control of postharvest fruit diseases[J].International Journal of Food Microbiology，2004，91：185-194.

[12] 童蘊慧，徐敬友，陈夕军.番茄灰霉病菌拮抗菌的筛选和应用[J].江苏农业研究，2001，24（4）：25-28.

[13] 郭达伟.果蔬保鲜剂的应用研究[J].中国农学通报，2001，17（3）：62-63.

[14] 胡俊.微生物学实验技术[M].呼和浩特：内蒙古文化出版社，2001.