酶固定化研究进展

胡鹏程 陈光

摘要目前酶作为一种性能优良的生物催化剂被广泛应用。由于酶在应用过程中的缺点如稳定性差、不能重复使用等，酶在工业化利用之前都要经过处理来改善酶的性能，于是固定化技术应运而生。通过模仿人体膜作用机理，使酶固定化，并且得到迅速的发展。主要阐述了医药学、化工、食品制造等方面固定化酶的应用情况以及该技术的一些最新研究成果。

关键词酶；固定化；改进；应用

中图分类号S188+3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04185-02

Advances in Studies of Enzyme Immobilization

HU Pengcheng et al（Jilin Agricultural University， Changchun， Jilin 130118）

Abstract As a biocatalyst with excellent performance， enzyme is widely used. However， due to its disadvantages in the application process， such as poor stability and impossibility of repeated use， it must be treated before industrial production. In this situation， people developed immobilization technology. Through simulating the action mechanism of the human membrane， enzyme immobilization technology is developing rapidly. This paper mainly elaborated application of enzyme immobilization in medicine and pharmacology， chemical industry， and food manufacturing industry， and latest advances in studies.

Key words Enzyme； Immobilization； Improvement； Application

酶作為一种生物催化剂可以在常温、常压下参与体内的各种代谢反应，具有高选择性、催化反应条件温和、无污染等特点，而且其数量和性质不会改变。酶具有亲水性，与疏水性底物冲突[1]；再者，通常的酶制剂是不可回收的，造成酶制剂成本昂贵；最后，受外界条件的影响，酶活性很不稳定。为了解决上述问题，固定化酶技术被提了出来。在20世纪60年代，固定化酶技术得到发展，即用固体材料将酶限制在一定区域内的技术[2-3]。固定化酶技术突破性地实现了酶的可回收利用，因而被广泛应用于食品、医药、化工等领域[4]。同时，关于酶固定化方法的研究也取得许多重要成果。

1固定化酶简介

美国科学家Nelson和Griffn于1916年最早发现了酶的固定化现象。我国的固定化酶研究开始于1970年。直到20世纪60年代，固定化技术才得到快速发展[5]。

固定化酶是一种酶工程的常见技术。酶将被吸附到一种惰性的低水溶性物质上即在一定空间内呈闭锁状态，能连续地进行反应。与游离酶相比，固定化酶具有以下优点：使酶在反应中被固定，从而易于从反应系统中分离，在较长时间内反复使用；反应过程易控制，有助于提高酶的稳定性；由于酶易与底物和产物分开，产物增加。它在工业和医药等方面有着诱人的应用前景。

2固定化方法

传统的固定化方法有吸附法、包埋法、共价结合法和交联法[6]。这些方法在使用中不会轻易改变酶的空间构相，所以可以较好地保存酶的活性，提高稳定性。但是，传统方法也有其自身难以避免的缺陷，故在酶的固定化技术使用范围仍然十分有限。

吸附法是酶与载体表面之间以范德华力结合，往往较弱[7]，使得酶与载体结合不牢，易脱落[8]。通常，这种力有离子键、氢键、疏水作用。由于使用价格低廉，载体可重复使用，酶便于回收。这是酶固定化技术中最经济的方法。其缺点是可能会由于吸附剂引起酶变性。宋宝东等[9]对源于Candida rugosa的脂肪酶在吸附树脂AB8载体上进行了吸附固定，固定化后酶活损失约30%，但稳定性提高约60%。

包埋法是高聚物和酶单体之间的聚合，即为了将酶固定化，使酶被包埋在聚合物中，从而实现酶的固定化的方法。酶活回收率较高[10]。该方法基本上没改变酶的结构，仅仅是将酶固定在聚合物形成的网格或微胶囊中。常用的包埋载体有海藻酸钠、明胶等[11]。其缺点是对酶的体积有要求。这是因为酶体积太大，会被聚合物形成一定的空间阻碍，影响包埋的过程。有研究人员用丙烯酰胺聚合载体包埋，葡萄糖氧化酶[12]。Bomscheur等[13]利用水性表面活性胶粒用乳液包埋，将酶相分离出来。

共价结合法是一种较成熟的方法[14]，即以共价键将酶和载体结合，使酶得以固定的方法。相较于前2种方法，共价结合法研究得较早，所以比较成熟。共价结合法可以将酶以共价键的方式固定，十分牢固，所以更耐受高浓度底物，但是由于底物离子强度大，该方法对酶的要求也变得极其苛刻，否则极易造成酶的蛋白质结构发生改变。薛屏等[15]将青霉素酰化酶以共价结合的方法固定在含铁MCM41介孔分子筛表面，发现固定化酶表观活性分别为782和256 U/g。

交联法是酶分子和交联剂形成共价键[16]将酶分子固定的方法。交联剂通常是双功能或多功能的试剂。由于交联过程中氨基咪唑基等基团极易参与反应，单用戊二醛做交联剂时极易造成酶失活。王慧玲等[17]以戊二醛为交联剂，以海藻酸钠为载体，固定脂肪酶，固定化酶活为22 895 U/g，酶活回收率为67.57%。可以看出，固定化酶的活化能力远高于游离状态的酶。

由于每种固定方法都有一定的使用限制，往往一种酶可以有很多方法去固定，但是没有一种像PCR普遍适用于基因工程那样的技术，普遍适用于酶的固定化。目前，通常将这几种方法结合，提高酶的活性和稳定性[18-19]。

3固定化方法的改进

通过现有的技术手段如声、光、电的应用可以得到很多新的产品。于是，这些方法也被广泛应用于酶固定化技术的改良中。目前，对于固定化技术的改进大多集中于制备新型固定化酶、制备新型载体、改变微环境增强酶活性以及进行化学修饰来增强反应活性等。

范超等[22]利用原子转移自由基聚合的方法制备了亲水聚合物修饰的硅胶颗粒，作为固定化酶载体，以标准蛋白质牛血清白蛋白（BSA）为样本，1 min即可完成酶解，肽段对BSA的氨基酸序列覆盖率达90%以上。对于酵母菌全蛋白质复杂样本的酶解，3 min酶解产物超过同样条件下溶液酶解12 h的鉴定结果。宋子风等[23]制备了鳞片状聚合物修飾的硅胶填料，并作为固定化酶载体，酶解标准蛋白质后肽段的氨基酸序列覆盖率达95%以上。

通常，表面活性剂可以使得酶的构像发生改变，从而由于静电结合导致活性中心始终处于暴露状态。用酰基，可以使青霉素酰化酶的丝氨酸活性中心裸露出来[24]。在水溶液中，酯酶的活性中心是处于封闭状态的，将酯酶固定于疏水表面，就会使得酯酶的活性中心处于完全开放的状态，从而保证酯酶的构象始终处于有活性状态[25]。

由于交联酶结晶具有良好的热力学稳定性和机械稳定性，它被广泛地应用于无载体固定化方法中。采用这种方法固定，可以有效防止枯草杆菌蛋白酶[26-27]蛋白分解。

4固定化技术的应用

4.1在现代医学和药品制备上的应用随着科学技术的进步，人们发现许多疾病与酶有密切关系[28]。酶进入人体后，因其具有蛋白质属性而产生免疫反应。通常由于稀释效应，酶无法集中于靶器官组织，导致不能保持最合适的治疗浓度，而固定化酶则很好地克服了游离酶的这些缺点。葡萄糖氧化酶被固定在纳米微带金电极上，可用于活体检测[29]。

目前，在疾病诊断、治疗等方面，酶正发挥着重要的作用。天冬酰胺酶可以用于白血病治疗，但是在实际操作中酶的作用通常是被限制的。这是由于当再次使用天冬酰胺时可能会引起免疫休克。为了消除这种抗原性，天冬酰胺酶的2个氨基可以用聚乙二醇修饰。吴梧桐等[30]对大肠杆菌L-天门冬酰胺酶Ⅱ进行化学修饰，使得酶抗原性显著减弱。陈吉祥等[31]将牛血Cu，ZnSOD用β环糊精修饰，抗炎活性增强，抗原性降低。

4.2在化学工业领域的应用酶在分析化学中的应用相当广泛，如用于检测癌症病人排泄物中乳糖含量的乳糖酶试纸。酶电极的研究使用最早且至今仍很受关注。在化工上，聚丙烯酰胺原位固定化碱性蛋白酶水凝胶球体可直接应用于洗涤剂的制备[32]。

4.3在食品工业的应用食品行业很早就开始利用酶的固定化技术[33]。王静等[34]以离子交换树脂D151为载体，固定化乳糖酶处理牛乳，乳糖水解率提高。从黑曲霉发酵液中提取β葡萄糖苷酶酶液，并将其固定，可应用于茶叶改良[35]。固定化的果胶酶可提高果汁的榨汁率[36]。

事实上，酶固定化技术的应用远不止于此。不难看出，酶的固定化技术已经与人们的生活息息相关，尤其是在食品工业方面较为普及。酶固定化技术正在以其优良的特性，逐步改变着人们的生活。

5展望

酶是一种高效的生物催化剂，但是由于传统的酶在水相中不稳定，它在工业大规模生产中不利于推广，故而产生了酶的固定化技术。这项技术现已被广泛地应用于现代医学和药品制备、化工和食品制造等领域。但是，传统的固定化方法很难制备出性能优异的酶。伴随着现代科技的进步，很多新的技术被应用于酶的固定化中，如更好地利用天然高分子材料，合成具有特定官能团的高分子载体，使得酶与载体在温和条件下共价偶联；改变空间结构是为了使酶可以突破因固定化而产生限制的常用的化学修饰方法；改变固定化酶所处的微环境，增强酶在局部空间内的活力等。现代酶固定化技术涉及生物、有机化学、材料学等学科，而新的固定化方法改善了酶的稳定性、催化活力、立体选择性和回收等性能。不难看出，很多学者在为建立一种可以普遍推广的固定化酶技术而努力。这也正是固定化酶技术发展的一个目标。一种酶往往可以用很多技术来固定，但是一种技术却很难适用于所有的酶，所以如同PCR技术的出现改变了分子生物学领域一样，如果固定化酶技术也能实现标准固定化，那么不亚于一次新的工业革命。

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