丙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞功能分析

宋铁英

【摘 要】目的：研究丙型肝炎患者丙型肝炎病毒（HCV）特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的功能。方法：将表达丙型肝炎病毒核心蛋白的真核表达质粒通过基因转染法转染HepG2细胞，并通过筛选获得稳定的转染Hep-Core细胞，使用蛋白质印迹法检测证实有HCV核心蛋白表达；分离患者外周血中的单个核细胞，经体外诱导扩增后得到HCV特异性CTL（HCV-CTL），以Hep-Core细胞和HepG2细胞作为靶细胞，运用乳酸脱氢酶释放法检测HCV-CTL的活性，用酶联免疫吸附法检测培养上清液中干扰素-γ（IFN-γ）的含量，选择10例正常人作为对照组。结果：丙型肝炎组患者HCV-CTL活性为（24.1±4.6）%，正常对照组为（43.2±6.1）%，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。丙型肝炎组患者靶细胞培养上清液中IFN-γ的浓度为（961±239）pg/ml，正常对照组为（3125±676）pg/ml， 两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：慢性丙型肝炎患者HCV-CTL活性降低，CTL的免疫功能低下与病毒水平和基因型有一定关系。

【关键词】丙型肝炎病毒；特异性细胞毒性T淋巴细胞；功能

【中图分类号】R373.2+1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）02-0763-01

慢性丙型肝炎是一种具有严重危害性的传染性疾病[1]。一些报道表明丙型肝炎患者CTL的免疫功能低下，只能起到抗感染的作用，无法抵抗感染细胞中的病毒，导致病毒一直存在于细胞中，最后可能诱发肝癌。本文对18例慢性丙型肝炎患者外周血中丙型肝炎病毒CTL的活性进行检测，研究了丙型肝炎患者丙型肝炎病毒CTL的功能。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

慢性丙型肝炎患者18例，其中男11例，女7例，年龄25-56岁，平均年龄41.32岁。所有患者均符合丙型肝炎相关诊断标准，排除乙肝和免疫缺陷病感染，且半年内没有接受抗病毒和免疫调节治疗。使用特异性引物聚合酶链式反应法进行丙型肝炎病毒基因型检测。此外选择10例正常人作为对照，其中男6例，女4例，年龄19-36岁，对照人员免疫缺陷病毒和肝炎标志物检测均为阴性，无饮酒和损肝药物使用史。

1.2 实验方法

使用PCR-SSP法对患者进行丙型肝炎病毒基因型检测。将表达丙型肝炎病毒核心蛋白的真核表达质粒通过基因转染法转染HepG2细胞，经筛选获得稳定转染的Hep-Core细胞，经过蛋白质印迹法检测证实有HCV核心蛋白表达；分离患者外周血中的单个核细胞，经体外诱导扩增获得HCV特异性CTL（HCV-CTL），以Hep-Core细胞和HepG2细胞作为靶细胞，运用乳酸脱氢酶释放法检测HCV-CTL的活性，用酶联免疫吸附法检测培养上清液中干扰素-γ（IFN-γ）的含量，以正常人作为对照组。

1.3 统计学处理

使用采用 SPSS15.0分析软件包对所得到的数据进行分析处理，计量资料采用方差分析和t检验，P<0.05，具有统计学意义。

2 结果

2.1 转染细胞中丙型肝炎病毒核心蛋白的表达

运用蛋白质印迹法检测证实使用HCV-C转染的HepG2细胞中有HCV核心蛋白表达，没有转染或空白的细胞中无HCV核心蛋白表达。

2.2 HCV-CTL活性检测

运用乳酸脱氢酶法分析18慢性丙型肝炎患者和10例正常人的HCV-CTL活性。丙型肝炎组患者的HCV-CTL活性为（24.1±4.6）%，正常对照组为（43.2±6.1）%，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 靶细胞培养上清液中IFN- γ浓度的测定

丙型肝炎组患者靶细胞培养上清液中IFN-γ的浓度为（961±239）pg/ml，正常对照组为（3125±676）pg/ml， 两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4 HCV-CTL活性和获得SVR的关系

本研究中另外选取完成常规抗病毒治疗的慢性丙型肝炎患者16例，其中获得SVR患者9例，无应答患者7例，均经过HCV-CTL活性检测。其中获得SVR患者的HCV-CTL活性为（41.5±2.6）%，无应答患者为（25.1±3.5）%，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

慢性丙型肝炎（CHC）是一种具有严重危害性的传染性疾病，主要通过血液传播。CHC的发病机制比较复杂，丙型肝炎病毒（HCV）和人体免疫系统的相互作用决定了该病的发生发展和转化。HCV慢性感染可能引发肝脏慢性炎症、纤维化等，严重者甚至会导致肝癌[2]。丙型肝炎患者CTL免疫功能和肝病的恶化程度有一定的关系[3]。CTL免疫功能低下包括细胞抗病毒能力下降、刺激后增殖能力下降、IFN-γ分泌减少等。丙型肝炎病毒感染细胞后机体会产生针对HCV的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫应答，CTL的数量和质量决定了机体阻止病毒感染恶化和清除病毒感染的效果。如果CTL的免疫应答较强，能够起到完全清除HCV的作用；如果CTL的免疫应答功能低下，只能起到抗感染的作用，无法抵抗感染细胞中的病毒，导致病毒一直存在于细胞中，最后可能诱发肝癌。

本次研究发现，慢性丙型肝炎患者HCV-CTL的活性明显低于正常人。研究显示细胞诱导后CTL培养上清液中IFN-γ浓度的浓度较正常人明显降低，这也说明慢性丙型肝炎患者CTL细胞的分泌能力明显下降，进一步导致其免疫功能低下。获得SVR患者的HCV-CTL活性明显高于无应答组，可见随着血液中HCV RNA水平的下降，细胞中HCV-CTL的活性显著提高，提示HCV-CTL活性和HCV RNA复制水平有一定相关性，CTL细胞的免疫功能和控制丙型肝炎病毒复制和清除的基因组有一定关系。

综上所述，本次研究表明慢性丙型肝炎患者HCV-CTL的活性降低，CTL的免疫功能會随之下降。慢性丙型肝炎患者HCV-CTL活性降低，CTL的免疫功能低下与病毒水平和基因型有一定关系。

参考文献：

[1] 窦晓光，丁洋.慢性丙型肝炎抗病毒治疗的新策略和新方法[J].中国实用内科杂志，2010，08（03）：54-55.

[2] 郭振华，陈青锋，赵正斌.HCV基因分型与干扰素疗效相关性探讨[J].临床检验杂志，2010，13（04）：42-43.

[3] 袁英.慢性丙型肝炎病人唾液及精液中无丙型肝炎病毒RNA[J].国外医学.内科学分册，2011，09（07）：71-72.