蓝萼甲素对宫颈癌Hela细胞增殖及细胞周期的影响

李嘉锌等

【摘 要】目的：研究蓝萼甲素对人宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用及对细胞周期的影响。方法：四氮唑噻唑蓝（ MTT ）法检测不同濃度蓝萼甲素分别在48， 72 h对Hela细胞的抑制作用； 流式细胞仪（ FCM ） 检测蓝萼甲素对Hela细胞周期的影响； Western blot法检测p53蛋白的表达。结果：不同质量浓度（ 2-20μmol/l） 蓝萼甲素对Hela细胞的毒性均有明显剂量和时间依赖性， 其48， 72 h的IC50值分别为：3μmol/l，1.5μmol/l； 蓝萼甲素可使Hela细胞细胞周期的构成发生明显的变化。Western blot表明， 蓝萼甲素作用Hela细胞后p53的蛋白水平表达逐渐升高。结论：蓝萼甲素对宫颈癌H e la细胞有细胞毒性，其作用机制可能是使Hela细胞生长停滞在G1期并诱导细胞凋亡，使S期细胞比例降低； 使p53功能恢复， 从而起到杀伤肿瘤的作用。

【关键词】宫颈癌； Hela细胞；蓝萼甲素；蛋白p53

【中图分类号】R737.33；R73.36 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）02-0576-02

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均居于女性恶性肿瘤前列。目前的研究显示宫颈癌的发生与高危型HPV感染密切相关，但并不是所有感染了HPV的患者都最终进展为宫颈癌，提示宫颈癌的发生发展还有多种因子参与。随中药提取工艺的提高，中药在宫颈癌治疗机制方面的研究更加细化。世界各个国家的医学研究均发现香茶菜属植物具有广泛的药理学作用，香茶菜属植物种类繁多，中医记载具有清热解毒、活血化瘀、抗菌消炎、抗肿瘤、治疗各种肝炎等功效。近年来对其中的二萜类化合物的研究较多。蓝萼甲素（Glaucocalyxin A，GLA）正是由唇形科香茶菜中分离提取出的二萜化合物，研究发现蓝萼甲素可抑制多种肿瘤细胞的增殖，如肝癌HepG2细胞株、卵巢癌HO8910细胞株、口腔鳞状细胞癌Tb细胞株、白血病HL-60细胞株等[1]。在抑制肿瘤细胞增殖方面，有研究显示蓝萼甲素通过抑制DNA， RNA和蛋白质合成而干扰细胞周期中的运行，延缓细胞周期，起到抗癌作用。本实验主要研究蓝萼甲素对宫颈癌细胞系Hela的细胞毒性、细胞周期的影响， 初步探讨其抗肿瘤作用的机制。

1 材料

1.1 试剂与药品 1640（购自Gibco公司）； MTT（四氮唑噻唑蓝， 四甲基偶氮唑盐） 购自Sigma-aldrich；胎牛血清购自碧云天生物技术研究所； 鼠抗人p53单抗购自碧云天生物技术研究所； 蓝萼甲素纯度> 98%，由新乡医学院药化实验室白素平教授及其课题组从蓝萼香茶菜中提取所得，纯度达98%以上， 使其溶解于适量的二甲基亚砜（ DMSO ） ， 终质量浓度为011% ， 过滤除菌， 4℃冰箱密封避光保存。112 仪器 CO2培养箱（美国Thermo E lectron Corporation），流式细胞仪（美国Beckm an A ltra ? ） ， 超净工作台（苏州精华设备公司） ， 倒置相差显微镜（日本Olympus公司），多功能酶标仪（Molecular Devices）， AE2405 电子分析天平（上海美特勒-托利多仪器有限公司） ， 细胞培养瓶，细胞培养板。

2 方法

2.1 细胞株与细胞培养 人宫颈癌细胞株Hela由新乡医学院病理实验室千新来教授赠与。Hela细胞接种于培养瓶，用1640 培养液（含10% 新生胎牛血清及青霉素、链霉素各100 U # mL-1） ， 置于37℃， 5%CO2饱和湿度的孵箱中培养， H ela细胞为梭形， 呈贴壁生长， 孵育2～ 3 d后用0.125% 胰蛋白酶消化传代， 选对数生长期的细胞进行试验。

2.2 MTT 法检测蓝萼甲素对He la细胞增殖的抑制作用 取对数生长期的Hela细胞，用0.125%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液后细胞计数， 将细胞密度调整为1×105/ml，空白对照组给予等体积的PBS；给药组分别加入不同浓度的蓝萼甲素，其质量浓度依次为48小时1，1.5，3，4.5，6，7.5，9，10.5，12，13.5。72小时浓度为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10。每个浓度设6个复孔。分别培养48，72 h后，加入10μl的MTT液（ 20 μL /孔）4h后，吸去上清加每孔加入150ul二甲基亚砜微型震荡器震荡10min，使完全混匀溶解结晶，在酶标仪上于578nm 处测其吸光度，每个剂量设平行重复6孔，实验重复3次。按以下公式计算抑制率， 拟合后求IC50值。细胞增殖抑制率= （ 1-A试验组/A对照组）×100%。

2.3 流式细胞仪检测蓝萼甲素对Hela细胞周期的影响 取对数生长的Hela细胞， 以1×105个/mL的密度接种于6孔板， 分别设有空白组、给药组（ 48，72h ）。蓝萼甲素给药质量浓度为（ 1.5μmol，IC50值） ， 空白组给予不加药物的细胞。培养24h后，胰酶消化，离心（ 1000 r# min-1，5min）， PBS洗2次，用70%的冷乙醇使细胞悬浮固，定轻轻吹打混匀，置4℃存12至24小时。碘化丙啶染色液染色后缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟。随后4℃或冰浴避光存放，后流式细胞仪监测分析，每组实验重复3次。

2.4 蛋白免疫印迹试验（Western blot） 给药后， 收集对数生长的Hela细胞，加入细胞裂解液，冰上放置15min， 12000 r# min- 1离心15m in，取上清，以Bradford法作蛋白定量后置-80℃贮存备用。灌制10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，常规电泳，转膜，封闭。一抗（ 1B500），4℃孵育过夜，二抗（ 1B5000），室温孵育2h，ECL显色。B-actin检测作为内对照， 进行细胞间蛋白表达的比较。

2.5 统计学处理 采用SPSS1310软件进行统计分析。实验数据以x±s 表示， 组间比较采用One-wayANOVA检验。

3 结果

3.1 蓝萼甲素对Hela细胞增殖的抑制作用

MTT法检测， 不同浓度的蓝萼甲素分别给药 48， 72 h后， 对Hela细胞的生长呈明显抑制作用。药物作用48， 72 h的IC50值分别为3，1.5μmol。结果表明细胞增殖的抑制率与药物浓度及作用时间密切相关， 单因素方差分析结果表明不同药物浓度与空白组间细胞抑制率有显著性差异（P <0.05或P < 0.01， 表1和表2）。

在时间相同浓度不同情况下，细胞的抑制率随浓度的增大而增大，在时间不同浓度相同的情况下，细胞的抑制率随时间的延长而增大。

3.2 流式细胞仪检测细胞周期

Hela细胞经给药组处理， PI染色后使用流式细胞仪进行监测分析。结果表明与空白对照组相比较，给药组效果更加显著， 使Hela细胞生长产生G1期阻滞， S期所占比例随给药时间的延长不断减少，Sub-G1减少。

本图72小时浓度为6，7.5 和空白对照组。

3.3 Western blot法对相关蛋白的检测

宫颈癌Hela细胞蓝萼甲素1.5μmol处理72小时后，Western blot法检测， 随着药物作用时间的延长， p53的表达逐渐增加（图）。

4 讨论

宫颈癌患者放疗后局部控制率低和远处转移率高， 严重影响其临床疗效， 因而高效低毒的放射增敏药物能广泛应用于基础和临床研究[2]。高立文等发现蓝萼甲素主要是通过作用于HL-60细胞后，导致氧自由基的爆发以及线粒体膜电位的下降，并导致线粒体细胞色素C的释放，调节有关凋亡蛋白的表达，从而诱导HL-60细胞凋亡的[3]。在抑制肿瘤细胞增殖方面，有研究显示蓝萼甲素通过抑制DNA， RNA和蛋白质合成而干扰细胞周期中的运行，延缓细胞周期，起到抗癌作用。另有研究发现蓝萼甲素也可能通过调节机体的免疫反应而抑制肿瘤的形成[4]。在宫颈癌方面，夏维和黄敬敬等分别在人宫颈鳞癌SiHa细胞和腺癌HeLa细胞中研究证实蓝萼甲素可明显抑制人宫颈癌细胞增殖，可能通过下调bcl-2的表达和上调bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinylaspartate-specific protease-3，caspase-3）、caspase-9的表达来诱导细胞发生凋亡和周期阻滞[5-6]。细胞凋亡与肿瘤发生、发展与消退有密切关系，某些抗肿瘤药物作用的强弱就与其诱导肿瘤细胞凋亡的活性成正比。因此，诱导肿瘤细胞凋亡成为研究抗肿瘤药物的新靶点， 以及评价疗效的一项新指标[ 7]细胞周期的阻滞与分化、细胞凋亡密切相关。如果S期占细胞周期的比例高， 则提示DNA的合成活跃。一般肿瘤细胞的S期比例较正常细胞要高， 其增殖活性也较正常细胞高， S期细胞明显减少， 说明其增殖活性已有所减弱[8].目前， 随着研究越来越广泛， 许多分化诱导剂能抑制肿瘤细胞生长及诱导其分化， 主要是由某些癌基因及抑癌基因的表达抑制、失活和活化所致， 其作用机制可能是通过抑制细胞原癌基因、诱导抑癌基因的表达， 抑制细胞进入S期及DNA合成， 从而诱导肿瘤细胞分化[9]。本实验通过MTT法检测显示，不同浓度的蓝萼甲素对Hela细胞毒性有明显剂量和时间依赖性； 流式细胞仪检测表明： 蓝萼甲素Hela细胞的细胞周期有明显的影响，在抑制He la细胞增殖的同时，可以诱导细胞周期阻滞在G1期， 使S期细胞比例降低， 使肿瘤细胞的增殖速度减慢， 抑制DNA的合成并加速诱导细胞凋亡。

P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，与人类的肿瘤有关，并发挥着重要的抑癌作用[10]。野生型p53能够发挥维持基因组稳定、抑制或阻止细胞转化的作用，从而能够抑制肿瘤的发生和发展。[10]。 p53与细胞DNA修复和细胞凋亡关系密切，是肿瘤抑癌基因之一[11]。在细胞发生DNA损伤时，P53蛋白能使细胞分裂中止在G1/S 期，以便细胞有足够的时间修复损伤，恢复正常状态[12]。本实验发现， 蓝萼甲素（1.5μmol/l）能够通过Western blot观察到p53蛋白表达增加。

综上所述， 蓝萼甲素能明显抑制宫颈癌Hela细胞的增殖， 其作用机理使p53的蛋白水平表达逐渐升高，p53启动，从而诱导Hela细胞凋亡。但其确切的作用机制还需进一步的研究证实。

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