芍药甙对高胆固醇血症家兔离体Oddi括约肌肌环张力作用的影响

王芳等

【摘 要】目的：观察芍药甙对高胆固醇血症（hypercholesterolemia， HC）家兔离体Oddi 括约肌肌环收缩活动的影响。方法：纯种新西兰大耳白家兔16只随机分成两组：对照组（control， CON）和高胆固醇血症（hypercholesterolemia， HC）模型组各8只，CON组饲以标准饲料，HC组饲以标准饲料+胆固醇（cholesterol， Ch），共饲8周。分别取两组SO制备成离体肌环，放置于平滑肌恒温灌流浴槽中，观察累积浓度芍药甙对SO肌环的舒张反应。结果：当芍药甙浓度累积达（100nmol/L、1?mol/L、10?mol/L、100?mol/L）时，对两组的SO肌环都产生剂量依赖性舒张作用（P﹤0.01）。但是模型组明显弱于对照组。结论：在离体条件下，芍药甙对正常兔和高胆固醇血症兔Oddi括约肌肌环均能产生剂量依赖性舒张作用，但高胆固醇血症兔Oddi括约肌肌环舒张性较正常兔下降，具体作用机制有待进一步研究。

【关键词】芍药甙；Oddi括约肌肌环；Oddi括约肌功能障碍；高胆固醇血症

【文章编号】1004-7484（2014）02-0456-02

近些年来，对SO生理性的认识已日益深入，加快了对SO病理生理条件下动力学变化的研究。早在1887年意大利生理学家Oddi发现SO时就指出，部分患者不明原因的腹痛、发热或黄疸可能是SO功能或器质性病变引起。经过国内外近20年的研究，Oddi括约肌运动功能障碍（sphincter of Oddi dysfunction， SOD）不但是大多数胆系疾病发病机制的主导环节，而且是这些疾患关键的继发病理生理改变。在胆道外科手术中，特别是肝胆结石的再手术率很高，复发结石是常见原因之一。通过对SO动力学改变与术后结石复发关系的研究，对胆道结石或胆管结石，由于各种原因如炎症、手术、高脂餐致使SO的“泵”功能障碍，加之胆囊排空功能损伤，胆汁排出受阻淤滞，胆汁成分改变，在成核因素作用下最终形成结石。杜凡等[1]发现高胆固醇使兔的SO基础压升高、收缩幅度降低，造影示SO有明显狭窄，而高胆固醇的持续存在进一步加大胆囊排空阻力使胆囊运动功能受损。魏经国等[2]对高胆固醇血症诱发Oddi括约肌功能紊乱实验研究中发现，高胆固醇可损害胆管Oddi括约肌的舒张功能，诱发Oddi括约肌功能紊乱，导致胆管Oddi括约肌排胆阻力增加而致胆囊淤胆。

临床上对Oddi括约肌功能紊有效的的治疗目前是经内镜括约肌切开，但是由于是一种有创的治疗，易引起胰腺炎的并发症，应用药物治疗在临床上取得了一定的疗效。芍药甘草汤是张仲景《伤寒论》的经典名方，具有酸甘化阴，缓急止痛的功效，能够缓解平滑肌痉挛。芍药甙是中药芍药甘草汤中芍药的有效成分，我们以前的研究证明，芍药甙能够对正常预处理收缩的兔SO肌环具有舒张作用。本实验我们通过制作高胆固醇血症（HC）兔模型，制备兔SO肌环，利用灌流法在离体条件下观察芍药甙对HC兔SO肌环收缩活动的作用，探讨其对胆道平滑肌的作用及可能的机制。

1 材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验仪器

PZ-1生物张力传感器（北京微信斯达科技发展有限公司）

BL-410生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）

TM_WAVE生物信号采集与分析软件（成都泰盟科技有限公司）

HW-400E恒温平滑肌槽（成都泰盟科技有限公司）

SMZ 800解剖显微镜（Nikon，Japan）

电子天平（型号：FA2004，d：0.1mg）

1ml可调式移液器。

1.1.2实验试剂和药物

芍药甙（批号TCM068-081221，南京替斯艾么中药研究所）

EGTA，美国Sigma公司；

氯化乙酰胆碱（Acetylcholine Chloride， Ach），美国Sigma公司；

胆固醇（分析纯），上海化学试剂公司；

二甲基亚砜（DMSO），天津化学試剂公司；

HEPES缓冲盐，美国Amresco公司；

NaCl，KCl，NaHCO3，MgCl2，NaH2PO4，葡萄糖（分析纯），天津化学试剂公司。

以下各种液体中成分均以毫摩尔/升（mmol/L）为计量单位。

Krebs-Henseleit（K-H）液（mmoL/L）：NaCl 118.3， KCl 4.7， NaHCO3 25.0， MgSO4 1.2， KH2PO4 1.2， CaCl2 2.5， glucose 11.0， pH=7.4；

1.1.3实验动物

纯种新西兰大耳白家兔，体重2.5～3.0kg，雌雄不限，由大连医科大学实验动物中心提供。

1.2实验方法

1.2.1高胆固醇血症家兔模型的制作

纯种新西兰大耳白家兔16只，2～3个月龄，体重2.5～3.0kg，随机分为2组，每组8只。对照组（CON）：饲以标准饲料；实验组（HC）：饲以标准饲料+Ch，每日1g，每周6d，停喂1d，共饲8周。高Ch血症模型判定标准[人类疾病的动物模型1982：120-129]：兔血清总Ch浓度小于3.0mmol/L为正常，大于10mmol/L为达到高Ch血症标准。分别于喂Ch前、过程中、测试前取静脉血测量血清总Ch含量。实验开始前将血清总Ch大于3.0mmol/L兔剔除。

1.2.2 SO肌环的制备

取家兔，经耳缘静脉注入约10mL空气处死兔迅速分离SO段，在解剖显微镜下小心去除SO周围脂肪与结缔组织，取其近心段并修剪成横径为4mm的肌环，对角线固定于通气管和张力换能器之间，置入含10ml K-H液的浴槽中，保持37℃恒温并持续通入体积分数为5%CO2 和95% O2的混合气体。

1.2.3 SO最适静息张力的调节[3]

将肌环置于K-H液中温育，首先给予1.0g初始前负荷，在平衡的过程中，不断调节张力，使其稳定在初始前负荷水平，每隔20min更换一次浴槽内的K-H液。平衡60min后以60mmol/L的KCl为激动剂，以0.2g为步幅逐步提高前负荷反复观察，直至其產生最大收缩力。此时的静息张力即为最适静息张力，随后实验均在各肌环最适静息张力下进行。

1.2.4 芍药甙对SO肌环张力的作用

实验组（n=8）采用累积加药法，每3min加芍药甙1次，使灌流液中芍药甙终浓度分别达10nmol/L，100nmol/L，1?mol/L，10?mol/L，100?mol/L，观察芍药甙对SO肌环的作用；对照组（n=8）以同样方法累积加药，每3min加芍药甙1次，使灌流液中芍药甙终浓度分别达10nmol/L，100nmol/L，1?mol/L，10?mol/L，100?mol/L，观察芍药甙对SO肌环的作用。

1.2.5 统计学方法

比较各组给药前后SO肌环收缩的程度，计算药后的收缩幅度与药前的比值。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学处理，数据用均数±标准差（ ）表示，两组间比较采用t检验， P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1血清总胆固醇浓度

正常兔血清总胆固醇Ch浓度﹤3.0mmol/L，与人血清总Ch浓度正常值近似（2.9～6.0 Ch）。参照复制兔动脉粥样硬化模型的方法[4]，本实验将血清总Ch浓度﹥10.0 mmol/L定为高Ch血症。各组兔喂Ch前血清总Ch浓度均正常[（1.4±0.8）vs （1.5±0.3） mmol/L， P﹥0.05]，8周后，实验组兔血清总Ch浓度明显升高（27.9±1.8）mmol/L，而对照组无明显变化（1.6±0.5）mmol/L，两组统计P﹤0.05，差异显著，实验组符合高Ch血症动物模型标准。

2.2两组肌环的物理参数

如表所示，两组SO肌环的外径、长度、重量均无显著差异。

2.3 芍药甙对SO肌环的舒张作用

先用60mmol/L的KCl预收缩肌环，等收缩力平稳后，加入累积浓度（10nmol/L～100?mol/L）的芍药甙，记录不同浓度下肌环舒张的百分率，由图看出与对照组相比，HC组SO肌环对芍药甙的舒张反应在各个浓度点明显降低。在100nmol/L时，HC组舒张率为19.6%，较对照组降低39%（P<0.01）；1?mol/L时，HC组舒张率为35.7%，较对照组降低41%（P<0.01）；10?mol/L时，HC组舒张率64.3%，较对照组降低24%（P<0.01）；100?mol/L时，HC组舒张率为73.8%，较对照组降低21%（P<0.01）。上述结果表明HC组对芍药甙舒张反应在上述各个浓度点均明显较对照组下降（P<0.01）。

3 讨论

SO位于胆总管、胰管与十二指肠交界处[5]，十二指肠乳头周围，由胆总管末端扩约肌、胰管扩约肌及壶腹括约肌三部分组成，为复杂肌性结构，富含平滑肌纤维。可分为固有肌和十二指肠延续肌纤维2类。固有肌有内外2层：内层主要为纵行肌，外层主要为环行肌，分别围绕管周围[6]。依靠其节律性收缩与舒张调节胆汁与胰液的排除，同时阻止十二指肠内容物返流入胆道和胰管，括约肌功能异常可以改变这种节律性的调节作用，诱发或加重胆胰疾病。SO运动障碍可导致反复发作性胆道样疼痛。胆囊切除术后综合征、慢性反复发作性胰腺炎均与SO运动障碍有关[7-8]。有人认为SO活动异常与胆道结石有密切关系[9]，因为基础压的升高，逆蠕动增加使胆汁潴留易于形成胆结石。SO功能异常包括器质性和功能性两大类，前者为括约肌炎症狭窄和纤维化，后者为SO的动力障碍，其症状与胃肠道功能紊乱类似，此时括约肌虽有收缩，但其生理功能已大打折扣。

SOD根据发病机制分SO狭窄和SO动力障碍两大类。狭窄由炎症、创伤、感染、结石、瘢痕等因素引起，SO动力障碍为SO的功能性失调，引起胆管或胰管的间歇性梗阻、括约肌痉挛，影响平滑肌功能可能是动力障碍的一个机制。

高胆固醇饮食已经被认为是健康的十大危险因素之一，它可能诱导循环系统疾病，胆道系统疾病，肾脏疾病，以及多种癌症。高胆固醇饮食和胆汁淤积之间的关系已经成为医学科学研究的重要课题。SO是胆汁流出的唯一通道，因此SO的功能障碍与胆囊胆汁淤积密切相关。SOD的主要症状就是SO的压力增高以及胆囊体积的增加。临床资料以及之前的发现都表明胆汁代谢紊乱可以导致SO的功能障碍，这是由SO持续性的收缩所导致的一系列的临床症状，包括腹痛及黄疸。

中药防治胆结石机理的实验研究始于20世纪50年代末，随着中西医结合治疗胆石症的不断发展和现代医学对胆结石成因研究的不断深入，中药防治胆结石机理的实验研究水平、技术也在不断提高。研究涉及了中药对胆道系统功能、胆固醇、胆红素代谢及胆道感染的影响，以及对胆结石形成具有重要意义的其他领域，初步揭示了中药防治胆结石的机理。早期的实验研究多围绕药物的泌胆和排胆效应，从胆汁流量、胆囊、胆道括约肌以及十二指肠的运动机能等四个环节进行动物实验，随着人们对胆汁成分改变在胆结石形成方面具有重要作用的认识，中药对高脂血症的影响一度成为研究热点，研究水平有了进一步的提高。中医认为胆石症的成因主要与肝胆有关，肝胆互为表里，同主疏泄，在生理上相互协调，在病理上互相影响.胆汁的生成和排泄由肝脏的疏泄功能控制和调节。肝气调达，疏泄正常，则胆汁排泄畅达；若情志不舒或暴怒伤肝，致使肝气郁结，肝失疏泄，导致胆汁排泄不畅，胆汁阻遏郁滞，郁而化热生火，火灼胆液，为砂石；肝经湿热，肝挟湿内扰于胆府，肝胆湿热互结，使中精之府湿热终日弥漫，胆汁浑浊，湿热薰蒸煎熬胆液日久成石。

中醫认为[10]，SOD病属“胁痛”、“黄疸”范畴，辨证证型有肝郁气滞、胃失和降、湿毒内蕴、发为黄疸型等，其病机为湿热蕴结、肝胆疏泄功能失常、脾胃运化不足、血瘀血热、腑实不通等。国内学者有关中医中药对平滑肌的舒张进行了大量的研究。尹本如等[11]证实重用大黄可疏通毛细胆管内的胆汁瘀积并且增加胆管舒缩功能，降低粘稠度，增加胆流，使胆囊收缩，舒张SO。李红芳等[12]报道大黄水煎剂可浓度依赖性地降低Oddi括约肌收缩波平均振幅和张力，减慢其节律性收缩频率，表现出抑制效应。现代药理研究发现[13]：中药厚朴中含有一种酚羟基的生物活性物质厚朴酚，能抑制细胞外钙内流，显示钙通道拮抗剂的特性。大黄素对大鼠和家兔离体回肠具有双向调节作用[14]，可通过增加细胞内 Ca2+的浓度，促进信号转导，加强胃肠运动[15]，这种作用对肠麻痹及痉挛可有调节治疗作用；中药成方或单味药的有效成分对改善SOD的作用机制有待进一步观察和深入。此外， 有实验发现[16]，甲基莲心碱（Nef）对SO和胆道均有与戊脉安相似的阻止外钙内流导致SO松弛的作用，并且发现Nef对胆道平滑肌的作用不同于血管平滑肌，他不拮抗去氧肾上腺素的收缩作用，为探索药物治疗SOD提供了实验理论依据[17-18]。总之，迄今为止还没有发现一种特异性作用于SO的药物。Wei JG et al.[19-21]已经观察到HC兔SO细胞[Ca2+]i处于过载状态。基于以上认识，本实验应用芍药甙对高胆固醇血症家兔离体Oddi括约肌肌环张力作用的影响。

本实验中，我们建立了高胆固醇血症模型并进行了芍药甙对Oddi括约肌肌环的影响，结果发现，给予家兔以高胆固醇饲料喂养后，其血清胆固醇含量明显升高，表明进食高胆固醇饲料可形成家兔的高胆固醇血症模型，与文献报道的较为一致[22]，家兔本身对胆固醇膳食的敏感性较高，对外源性胆固醇吸收率达75%～95%，对高胆固醇血症清除能力低，易于建立模型。对各实验组记录芍药甙对离体Oddi括约肌肌环收缩活动的直接作用与对照组比较，给予高胆固醇血症饲料喂养的模型组，存在SO肌环的舒张作用，但其作用明显弱于对照组（P﹤0.01）。

研究表明，芍药甙对正常纯种新西兰大耳白家兔离体Oddi括约肌肌环具有剂量依赖性舒张作用，对高胆固醇血症兔的这种作用依然存在，但是被弱化，说明经过高胆固醇饲料喂养后，SO运动功能增强，提高了SO张力，导致SOD [24]，从另一方面说明，SOD后Oddi括约肌舒张功能减弱。

我们以前的研究结果表明，芍药甙对SO肌环的舒张作用是通过多种途径实现的。芍药甙可能通过对Kv通道和BKCa通道的调控，实现了对正常家兔Oddi括约肌肌环的舒张反应；另一条途径可能与阻断平滑肌细胞内质网上的三磷酸肌醇敏感的钙离子通道，抑制内钙的释放有关。在离体条件下，我们又初步观察到芍药甙对高胆固醇血症兔SO肌环也具有舒张作用，其作用机制是否与芍药甙对正常家兔SO肌环的舒张作用一致？有待进一步研究阐明。

参考文献：

[1] 杜凡，魏经国，等. 胆囊成石过程Oddi括约肌功能与超微结构 [J]. 中华肝胆外科杂志， 2002， 8（10）：605-608.

[2] 魏经国，杜凡，王耀程，等. 高胆固醇诱发Oddi括约肌紊乱实验研究 [J]. 中国病理生理杂志， 2000， 16（5）：446-450.

[3] 张孝勇，马进，杜滂，等. 高胆固醇血症兔Oddi括约肌细胞钾离子通道活性的改变 [J]. 世界华人消化杂志， 2007， 15（3）：216-220.

[4] 苏敬东，李世俊，赵浩亮. 咖啡因预防家兔胆囊结石形成的研究 [J]. 中华实验外科杂志， 1994， 11（1）：27-28.

[5] Kawamoto M， Geenen J， Omari T， Schloithe AC， Saccone GT， Toouli J. Sleeve sphincter of Oddi （SO） manometry： a new method for characterizing the motility of the sphincter of Oddi. [J]. Hepatobiliary Pancreat Surg， 2008， 15：391-396.

[6] 陈道邦，周德明，杨开清，李光明. Oddi括约肌形态特征及其意义 [J]. 中国临床解剖学杂志， 2001， 19：229-230

[7] 陈晓星，莫剑忠，刘文忠，等. 胆囊切除术后综合征Oddi括约肌运动的研究 [J]. 中华内科杂志， 1991， 30（6）：237-239.

[8] Tzovaras G， Rowlands BJ. Diagnosis and treatment of sphincter of oddis dysfunction [J]. Br J Surg， 1998， 85（5）：588-595.

[9] 覃汉荣，徐明符. 内镜下Oddi括约肌测压术的应用及意义 [J]. 国外医学·内科学分册， 1997， 24（10）：436-439.

[10] 李军. 中医辨治胆囊切除术后综合征的思路与方法 [J]. 中医杂志， 2007， 48（11）： 1033- 1034.

[11] 尹本如，闵锐，方敏. 中西医结合治疗胆道术后奥狄括约肌狭窄13例 [J]. 中国中西医结合外科杂志， 2008， 8（1）：44.

[12] 李红芳，汪龙德，郑天珍. 大黄水煎剂对离休兔Oddi括约肌和十二指肠平滑肌收缩活动的影响 [J]. 兰州医学院学报， 2003， 29（3）：1-2.

[13] Teng CM， Yu SM， Chen CC， et al. EDRF-release and Ca2+-channel blockade by magnolol， an antiplatelet agent isolated from Chinese herb Magnolia officinalis in rat Thoracic aorta [J]. Life Sci， 1990， 47（13）：153-162.

[14] 呂金胜，何凤慈，刘霞东. 大黄素对动物离体回肠收缩作用的影响 [J]. 药物研究， 2000， 9（11）：25-29.

[15] 刘勇，齐清会. 大承气冲剂治疗对多器官功能不全综合征胃肠Cajal间质细胞形态学影响 [J]. 中国中西医结合外科杂志， 2007， 13（1）：51-56.

[16] 吴高松，邹声泉. Oddi括约肌功能异常的诊断与治疗 [J]. 中华肝胆外科杂志， 2003， 9：442-444.

[17] 邹声泉，胡文淑. 甲基莲心碱对离体胆道Oddi括约肌的作用 [J]. 中华实验外科杂志， 1995， 12：298-299.

[18] 丁庆，谭俊峰，张丽娟，等. 甲基莲心碱对豚鼠离体胆道平滑肌的作用 [J]. 同济医科大学学报， 1996， 25：264-266.

[19] Wei JG， Wang YC， Du F， Yu HJ. Dynamic and ultrastructural study of sphincter of Oddi in early-stage cholelithiasis in rabbits with hypercholesterolemia [J]. World J Gastroenterd， 2000， 6（1）：102-106.

[20] 杜凡，魏经国. 高胆固醇血症兔胆道口括约肌动力功能与一氧化氮合酶关系 [J]. 第四军医大学学报， 2000， 21（11）：1402-1405.

[21] Wang XJ， Wei JG， Wang YC， Xu JK， Wu QZ， Wu DC， Yang XX. Effect of cholesterol liposomes on calcium mobilization in muscle cells from the rabbit sphincter of Oddi [J]. World J Gastroenterol， 2002， 8（2）：144-149.

[22] 赵纪春，舒晔，程南生，等. 胆囊结石中胆固醇代谢变化的实验研究 [J]. 中国普通外科杂志， 2000， 9（2）：124-128.

[23] 王小军，朱志立，李虎城，等. 一氧化氮在高胆固醇血症家兔Oddi括约肌中的含量变化 [J]. 局解手术学杂志， 2007， 16（4）：229-231.

[24] Matharoo B， Ashford ML， Arulkumaran S， et al. Down regulated expression of the β1 subunit of the big-conductance Ca2+ sensitive K+ channel in sphincter of Oddi cells from rabbits fed with a high cholesterol diet. [J] Biol Reproduct， 2003， 68：2135-2141.