IL-18在病理性瘢痕中的表达及其生物学意义

吴泽勇 张培华 李瑾 李小芳 杨春燕

[摘要]目的：比较IL-18在正常皮肤和病理性瘢痕组织中的表达及分布情况，探讨IL-18在病理性瘢痕的形成过程中所起的生物学作用及意义。方法：收集2006年12月到2007年6月广东医学院附属医院整形外科手术切除的正常皮肤10例，增生性瘢痕组织12例，瘢痕疙瘩12例，应用免疫组织化学技术及荧光定量RT-PCR分别检测IL-18蛋白及IL-18 mRNA在它们中的表达水平及分布情况。结果：IL-18在正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中均有表达，IL-18mRNA和 IL-18蛋白在瘢痕疙瘩组和增生性瘢痕组之间无明显差异(P>0.05)，但两者均低于正常皮肤组(P<0.05)。结论：IL-18可能是病理性瘢痕组织的形成促进因素之一。

[关键词]IL-18；增生性瘢痕；瘢痕疙瘩；RT-PCR；免疫组织化学

[中图分类号]R619+.6 [文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2014）06-0454-03

The expression of IL-18 in pathological scars and its biological effect

WU Ze-yong,ZHANG Pei-hua,LI-Jin,LI Xiao-fang,YANG Chun-yan

（1.Department ofPlastic Surgery, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001,Guangdong,China; 2.Department ofPathology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College; 3.Surgery Laboratory of Clinical Skills Training Center,Guangdong Medical College）

Abstract:ObjectiveComparing the expression and distribution of IL-18 in the normal skin and pathological scars, To explore the biological contribution of lL-18 in the formative course of hypertrophic scard.MethodsFrom December 2006 to June 2007，10 cases of normal skin, 12 cases of proliferative scar and 12 cases of keloid tissues were collected at Department of Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College.Take normaI skin as control group,Applicating immunohistochemical technique and fluorescence quantitative RT-PCR, to detect the expression level and distribution of IL - 18 protein and IL - 18 mRNA in them. ResultsThe expression of IL-18 protein and IL-18 mRNA was both obviously lower in hypertrophic scar and keloid tissues compared with those of narmal skin respectively y(P<0 05).ConcIusionThe results indicated that IL-18 maybe one of the factors to promote pathological scar tissue forming.

Key words:IL-18;hypertrophic scars;keloid;RT-PCR;immunohistochemical

病理性瘢痕为皮肤创伤后形成的过度增生性疾病，破坏人体表面完整性和组织器官正常结构，导致创伤部位畸形，功能障碍，影响美观，给患者带来极大的心理和经济负担。目前，其发病机制尚未完全清楚，一般认为是由创伤的迁延愈合，修复细胞中成纤维细胞的大量增殖与凋亡抑制，细胞外基质中胶原合成与降解失衡所引起，主要包括增生性瘢痕及瘢痕疙瘩，其中瘢痕疙瘩又称瘢痕瘤，具有某些良性肿瘤的特征，与肿瘤发生在分子生物学基础上存在许多共同点。白细胞介素18(Interleukin-18，IL-18)能刺激 T 细胞及 NK 细胞分泌 IFN-γ，增强穿孔素及 FasL 介导的细胞毒作用, 在增强免疫、抗肿瘤、抗微生物感染等方面具有重要作用, 并在肿瘤的生物治疗中表现出广泛应用前景。IL-18是否在病理性瘢痕的形成中发挥作用，目前国内尚未见报道。本实验通过观察 IL-18 在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中的表达水平和分布情况，探讨IL-18与病理性瘢痕的关系。

1材料和方法

1.1 材料：收集2006年12月至2007年6月广东医学院附属医院整形外科手术切除的标本共34例，其中，瘢痕疙瘩组织12例，男性4例，女性8例，年龄15～36岁，平均23岁；增生性瘢痕组织12例，男性5例，女性7例，年龄10～37岁，平均18.5岁；正常皮肤10例，男性5例，女性5例，年龄18～45岁，平均26岁。正常皮肤取自除皱、包皮环切术及外伤多余皮肤，病理性瘢痕取材部位为颜面、前胸、腹部、四肢等，病程为3～24月，患者无慢性病史及长期服用药物史，瘢痕未进行局部药物注射治疗，患者知情同意。标本切取后去除皮下组织，用生理盐水清洗，用组织剪将组织块修成0.5cm×0.5cm大小，部分迅速置于液氮保存；部分置入4%中性甲醛溶液中固定，经常规脱水、石蜡包埋备用。

1.2real time RT-PCR检测IL-18 mRNA的表达：引物由上海意泓生物科技有限公司合成， Interleukin 18上游引物：5' -CAAGGAAATCGGCCT CTATTT-3'；下游引物：5' - CCTCTAGGCTGGCTATCTT TATACATACT-3'。内参照GAPDH上游引物：5'-GGTGGACAGCGAGGCCAGGAT-3'，下游引物：5'-TTG CCGACAGGATGCAGAAGGA-3'。第一步按照Trizol试剂盒（TOYOBO公司）操作说明书提取标本总RNA，逆转录成cDNA；第二步做荧光定量PCR，95℃ 5min；接着95℃ 15s，60℃ 15s， 72℃ 32s；40个循环（72℃ 32s收集荧光信号）；同时，以GAPDH为内参，结果采用比较法测定目的基因的相对表达（即目的基因量= 2△△Ct），分析病理性瘢痕组织与正常皮肤IL-18 mRNA的表达差异。

1.3 免疫组织化学技术检测IL-18蛋白的表达：标本切取后，常规制备石蜡切片，干燥保存。按IL-18试剂盒（Santa Cruz, Europe）说明书进行免疫组织化学（SP法）检测。每批标本均用 PBS 代替一抗作为空白对照。IL-18 阳性表达定位于细胞膜和细胞浆，均呈棕黄色颗粒或团快样分布。每张染色切片由两人分别对实验结果进行双盲法评估。采用IPP7.0图像分析软件，每张染色切片自表皮层向真皮层按系统抽样法随机抽取5个高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的累积光密度和所有细胞总面积，以每例5个视野的平均光密度作为该例的测量值，平均光密度=阳性反应的累积光密度/细胞总面积。

1.4 统计学分析：采用SPSS15.0统计学软件分析实验数据，计量结果用均数±标准差(x±s)表示，三组间差异采用方差分析和q检验。

2结果

2.1 IL-18 mRNA在正常皮肤及病理性瘢痕中的表达：IL-18 mRNA扩增曲线呈典型的S型，熔解曲线为单峰，排除非特异性扩增及引物二聚体的出现。10例正常皮肤、12例增生性瘢痕和12例瘢痕疙瘩的实时荧光定量RT-PCR相对转录量检测结果分别为1.6513±0.2632、1.2931±0.1805、1.3058±0.2107。正常皮肤表达量均高于增生性瘢痕和12例瘢痕疙瘩，差异有统计学意义(P均<0.05)；增生性瘢痕和瘢痕疙瘩表达量相近，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 IL-18蛋白的在正常皮肤及病理性瘢痕中的表达：IL-18蛋白的表达定位于细胞浆及细胞间质中，呈棕黄色，在正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中均有表达，主要集中于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩表皮的颗粒细胞层、棘细胞层和基底细胞层的细胞与正常皮肤真皮层的成纤维细胞及其结缔组织、毛细血管、淋巴管中，从总体上看，增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组中IL-18蛋白相对表达量均较弱，见图1～4，差异无统计学意义(P>0.05)，两者均低与正常皮肤组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

1995年日本学者Okamure等[1]首次从灭活痤疮丙酸杆菌和脂多糖共处理过的中毒性休克小鼠肝脏的一种由应激诱生的蛋白，由于这种细胞因子能诱导Thl等细胞产生γ干扰素，因而起初被命名为IFN-γ诱生因子，1996年Ushio等[2]克隆出人类IGIF的cDNA并在E.Coli中表达，鉴于IGIF的氨基酸序列与IL-1α、IL-1β有同源性，但缺乏IGIF与IL-1受体结合的证据，继而研究发现该因子还具有多种生物学活性，因此被重新命名为白介素18（IL-18）。IL-18为多功能细胞因子，能刺激T 细胞及NK 细胞分泌IFN-γ ，增强穿孔素及FasL 介导的细胞毒作用，在自身免疫性疾病、心衰、肺气肿、急性肾炎、抗微生物感染等方面具有重要的作用[3]。在肿瘤研究方面，已有体外细胞实验证明，IL-18能通过腺病毒介导的，过度产生IL-18，能有效的抑制肾癌细胞和前列腺癌细胞的生长[4-5]。动物体内试验提示，IL-18通过FasL-Fas系统，提高细胞毒性CD+T淋巴细胞的活性，抑制骨肉瘤细胞生长。

瘢痕疙瘩是人类特有的一种良性的皮肤纤维增殖肿瘤，具有肿瘤生长的某些特点[6]。很多抑制肿瘤生长及转移相关的细胞因子，都被引入到病理性瘢痕的研究中，并取得良好的效果。IL-18通过T细胞和NK细胞介导IFN-γ的分泌及FasL-Fas系统促进细胞凋亡，抑制肿瘤的发生发展[7]。IL-18是否通过类似的途径，促进成纤维细胞凋亡而抑制瘢痕增生，在瘢痕的发生发展中发挥怎样的重要作用呢？

目前研究已证明，IFN-γ通过TGF-β/Smad上调Smad 7、下调Smad 3，减少CTGF和α-SMA，抑制瘢痕增生[8]。而增生性瘢痕及瘢痕疙瘩均有Fas表达，后者表达量更高，但其敏感性均较低，提高Fas的敏感性将是瘢痕治疗的一个重要靶点[9]。IL-18能分泌IFN-γ且可通过FasL-Fas系统促进细胞凋亡。因此我们将IL-18基因引入到病理性瘢痕当中进行研究，通过定量RT-PCR检测，结果表明IL-18基因在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中表达与正常皮肤相比较，明显减弱(P<0.05)，说明，IL-18基因在mRNA转录水平已经存在异常。

免疫组织化学的实验结果提示，IL-18蛋白在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中表达与正常皮肤相比较，明显减弱(P均<0.05)，说明IL-18蛋白在翻译水平也存在异常。由定量RT-PCR结合免疫组织化学结果，我们可以初步推断，与正常皮肤组织相比，病理性瘢痕组织中，IL-18mRNA表达异常，导致IL-18蛋白合成的减少，继而细胞IFN-γ分泌减少及FasL-Fas系统活性降低，使瘢痕组织中成纤维细胞的增殖与凋亡失衡，最终导致瘢痕组织的增生。

[参考文献]

[1]Okamura H,Nagata K,Komatsu T,et al.A novel costimulatory factor for gamma interferon induction found in the livers of mice causes endotoxic shock[J]. Infect Immun,1995,63(10):3966-3972.

[2]Ushio S,Namba M,Okura T,et al.Cloning of the cDNA for human IFN-gamma-inducing factor, expression in Escherichia coli,and studies on the biologic activities of the protein[J]. J Immunol,1996,156(11):4274-4279.

[3]Dinarello CA,Novick D,Kim S,et al.Interleukin-18 and IL-18 Binding Protein[J].Frontiers in Immunology,2013(4):289.Review.

[4]Kyung-Sun Hwang, Won-Kyung Cho,Jinsang Yoo,et al. Adenovirus-mediated interleukin-18 mutant in vivo gene transfer inhibits tumor growth through the induction of T cell immunity and activation of natural killer cell cytotoxicity[J].Cancer Gene Therapy,2004(11): 397-407

[5]Cheng B,Nong SJ,Zhang YP.Adenovirus-mediated combined gene therapy of interleukin-18 and interleukin-12 for prostate cancer:an experimental study[J].Zhonghua Yixue Zazhi,2013, 93(20):1590-1593.

[6]Giuseppe Palma,Antonio Barbieri,Sabrina Bimonte,et al.Interleukin 18: Friend or foe in cancer[R].Biochimica et Biophysica Acta,2013,176:296-303.

[7]张玉龙,李世荣.NF-κB信号通路在瘢痕疙瘩形成中的作用[J].中国美容整形外科杂志,2012,23(7)：434-436.

[8]Liu JQ,Hu DH,Zhang ZF,et al.Effects of interferon-gamma on the transforming growth factor beta/Smad pathway in keloid-derived fibroblasts[J].Zhonghua Shaoshang Zazhi,2009,25(6):454-459.

[9]Feng Lu,Jianhua Gao,Rei Ogawa,et al.Fas-mediated apoptotic signal transduction in keloid and hypertrophic scar[J]. Plast Reconstr Surg,2007,119:1714-1721.

[收稿日期]2014-01-26[修回日期]2014-03-04

编辑/张惠娟