野生花脸香蘑多糖提取工艺优化

伦志明　池玉杰　韩树英　尹立伟

摘要[目的]研究野生花脸香蘑子实体多糖的最佳提取工艺条件。[方法]采用热水浸提法提取野生花脸香蘑子实体多糖，通过单因素试验研究浸提时间、浸提温度、料液比、提取次数对多糖得率的影响，并在单因素试验的基础上，进行正交试验获得最佳提取工艺。[结果]在提取次数为2次的前提下，野生花脸香蘑子实体多糖的最佳提取工艺条件为：浸提温度65 ℃，料液比1∶40（g/ml），提取时间5 h；在此条件下，提取花脸香蘑子实体水溶性多糖，得率为10.39%。[结论]试验优选了野生花脸香蘑子实体多糖的提取工艺条件，为野生花脸香蘑多糖的生产提供了理论依据。

关键词野生花脸香蘑[Lepista sordida （Schum.：Fr.）Sing]；多糖；正交试验

中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）07-02113-03

基金项目黑龙江省自然科学基金项目（C200931）。

作者简介伦志明（1971-），女，黑龙江海伦人，副教授，博士研究生，从事食用菌相关方面研究。

收稿日期20140217食药用真菌中具有药理活性的物质有很多，而多糖则是其中最广为人知、最有效的抗肿瘤和免疫调节活性物质，它们可以从食药用真菌的子实体、菌丝体和发酵液中分离出来[1]。从20世纪70年代开始，菌丝中提取的云芝多糖、子实体中提取的香菇多糖和发酵液中提取的裂褶菌多糖在抗癌临床治疗方面取得了良好效果[2]。40多年间，各国学者对包括灵芝、云芝、灰树花、平菇、蛹虫草、黑木耳等在内的近700种担子菌多糖的活性进行了研究[3]。结果显示，这些多糖表现出较强的抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗病毒、降低血糖和降低血脂等多种药理活性[4-10]，而且由于天然、毒副作用小的特点，使它们成为了潜力巨大的功能性食品和药物的来源。自然界的食药用真菌约有140 000种，人类已知的约有14 000种[11]，仍有庞大的食药用真菌群体做为多糖资源去等待人类开发与利用。

花脸香蘑[Lepista sordida （Schum.：Fr.）Sing]为伞菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）香蘑属（Lepista）真菌，广泛分布于黑龙江、河北、河南、甘肃、青海、四川、新疆、西藏、山西、内蒙古、广西、云南、湖南、重庆、贵州、江西和福建等地[12]。因生物转化率较低，子实体易碎，不耐运输，目前尚未大面积推广栽培，市场上完全依赖于野生资源。对于这种气味浓香、色泽宜人、味道鲜美、在民间享有很高知名度的名贵食用菌，多糖的研究才刚刚开始。张振宇等以中药渣对花脸香蘑进行固体发酵，发现其粗多糖提取物在一定浓度下对小鼠NK细胞活性具有明显增强作用[13]。另有研究表明，花脸香蘑多糖具有抗肿瘤活性[14]，对肝细胞有保护作用[15-16]。孟玲等对花脸香蘑菌丝多糖的发酵条件进行了研究，结果表明，在适量蔗糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾，蒸馏水1 000 ml的培养条件下，菌丝体多糖提取率最高[17]。笔者以野生花脸香蘑子实体为原料，采用单因素试验及正交试验优化花脸香蘑多糖的热水提取工艺，以期为花脸香蘑多糖的开发和利用提供科学的理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1 研究对象。花脸香蘑，采自黑龙江省齐齐哈尔市双河农场，经形态观察及ITS序列分析鉴定为花脸香蘑（Lepista sordida），序列已经提交GenBank，序列编号为KF874612。

1.1.2 主要仪器。DKS26恒温水浴锅，购自上海森信试验仪器有限公司；Cary50紫外分光光度计，购自美国VARIAN公司；SORVALL LEGEND RT台式冷冻离心机，购自德国Heraeus公司；FD5505真空冷冻干燥机，购自美国SIM公司；FW100高速万能粉碎机，购自北京中兴伟业仪器有限公司；循环水真空泵，购自郑州长城科工贸有限公司。

1.1.3 主要试剂。葡萄糖、重蒸酚、浓硫酸和95%乙醇等试剂均为国产分析纯，市售。

1.2方法

1.2.1 试验样品预处理。取花脸香蘑子实体，自然风干后，置于60 ℃烘箱中烘至恒重，以高速万能粉碎机粉碎，过60目筛，加入8倍体积浓度95%乙醇，室温放置过夜，抽滤后，上清液密封放置，沉淀复加乙醇，过夜、抽滤，如此反复操作3次，合并上清液，旋转蒸发仪回收乙醇，沉淀置阴凉通风处风干，备用。

1.2.2 苯酚-硫酸法测定多糖含量[18]。

1.2.2.1 苯酚溶液配制。称取80.00 g重蒸苯酚，加入20 ml蒸馏水使之溶解，制成浓度80%苯酚溶液，置于4 ℃冰箱中避光保存，使用前加蒸馏水稀释成浓度6%苯酚溶液。

1.2.2.2 葡萄糖标准溶液配制。称取葡萄糖10.0 mg，105 ℃烘至恒重，加蒸馏水溶解定容至250 ml，配制成40 μg/ml葡萄糖标准溶液。

1.2.2.3 线性关系的考察。用移液器吸取葡萄糖标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8 ml，置于10 ml离心管中，以蒸馏水补充至2.0 ml，以2.0 ml蒸馏水作为空白对照，各加入1.0 ml浓度6%苯酚溶液，混合均匀，再加入5.0 ml浓硫酸，振荡摇匀，沸水浴中加热15 min，取出后用自来水冷却，紫外分光光度计测490 nm波长处吸光度，以吸光度为（Y）纵坐标，葡萄糖质量浓度（X，μg/ml）为横坐标，制作标准曲线，计算线性回归方程。

1.2.2.4 花脸香蘑多糖提取得率的测定。多糖提取率按下列公式计算：多糖提取率（%）= （C×V×D/M）×100；其中，C为提取液中葡萄糖浓度（mg/ml），V为提取液容积（ml），D为提取液稀释倍数，M为试验样品质量（mg）。

1.2.3 花脸香蘑多糖提取单因素试验。（1）料液比对花脸香蘑多糖的影响。取花脸香蘑子实体粉末10.00 g，称取5份，按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/ml，W/V，下同），在95 ℃条件下浸提2 h，设置3个重复，浸提后提取液离心，测量容积，取1.0 ml提取液，稀释至适当倍数，按苯酚-硫酸法用紫外分光光度计测定490 nm波长处吸光度，比较不同料液比条件下的多糖提取率。（2）提取温度对花脸香蘑多糖的影响。取花脸香蘑子实体粉末10.00 g，称取7份，按上述试验确定的料液比，分别于35、45、55、65、75、85和95 ℃水浴中加热2 h，设置3个重复，浸提后提取液离心，测量容积，取1.0 ml提取液，稀释至适当倍数，用苯酚-硫酸法在490 nm波长处测定吸光度，比较不同温度条件下的多糖提取率。（3）提取时间对花脸香蘑多糖的影响。取花脸香蘑子实体粉末10.00 g，称取5份，按上述试验确定的料液比和温度，分别提取1、2、3、4和5 h，设置3个重复，浸提后提取液离心，测量容积，取1.0 ml提取液，稀释至适当倍数，按苯酚-硫酸法在490 nm波长处测定吸光度，比较不同时间条件下的多糖提取率。（4）提取次数对花脸香蘑多糖的影响。取花脸香蘑子实体粉末10.00 g，称取4份，按上述试验确定的料液比、温度和时间，分别提取1、2、3和4次，设置3个重复，浸提后提取液离心，合并上清液，测量容积，取1.0 ml提取液，稀释至适当倍数，按上述苯酚-硫酸法在490 nm波长处测定吸光度，比较不同提取次数条件下的多糖提取率。

1.2.4 正交试验。在单因素试验基础上，以提取温度（A）、料液比（B）、提取时间（C）为考察因素，采用L9（33）正交表设计试验组合（表1），每个组合设置3个重复，提取次数为2次，使用统计分析软件SPSS17.0分别对单因素试验及正交试验进行方差分析。

2 结果与分析

2.1线性关系的考察 计算得线性回归方程为：Y=0.014 9X-0.002 6，R2=0.997 3。试验结果表明，在1.6～7.2 μg/ml范围内，葡萄糖浓度与吸光度的线性关系良好。