生物技术在草莓遗传育种中的应用

温映红　杨明霞　王俊宇　韩凤

摘 要：概述了近年来国内外关于生物技术在草莓遗传育种中的应用研究进展。重点对草莓组织培养技术、分子标记技术、基因工程技术在草莓遗传育种中发挥的作用及应用现状进行了总结，主要包括组织培养应用于草莓育苗，利用分子标记进行遗传图谱构建及抗病性辅助选择，利用基因工程技术进行草莓基因功能验证及遗传性状定向改良等，分析了各种现代生物技术应用于育种研究的可行性。最后，对各种生物技术的局限性进行了总结和归纳，探讨了现代生物技术与常规育种技术相结合的利用途径及发展方向，旨在为今后草莓遗传育种工作提供参考和理论依据。

关键词：生物技术；草莓；遗传育种

中图分类号：Q789 文献标志码：A 论文编号：2014-0209

Application of Biotechnology in Genetics and Breeding of Strawberry

Wen Yinghong， Yang Mingxia， Wang Junyu， Han Feng

（Pomology Institute， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taigu 030815， Shanxi， China）

Abstract： This review introduced the progress about application of biotechnology in the strawberry genetics and breeding from abroad and home researches in recent years. The role and the status of application about tissue culture technology， molecular markers and genetic engineering technology in the strawberry genetics and breeding were summarized mainly including the application of tissue culture in strawberry breeding， the using of molecular markers about the constructing of genetic maps and molecular marker-assisted selection for disease resistance， the using of genetic engineering technology about functional verification of strawberry genes and the directional genetic improvement of horticultural traits and so on. The feasibility of modern biotechnologies were applied to breeding research was analyzed as well. Finally， the limitations of various biotechnologies were summarized， the utilization way and development direction of modern biotechnology combined with conventional breeding technology was discussed. Overall， this review aimed at offering basic knowledge about genetic breeding work of strawberry.

Key words： Biotechnology； Strawberry； Genetics and Breeding

0 引言

草莓是蔷薇科草莓属的一种多年生宿根草本植物，是温带地区的一种常见水果。其果实营养价值较高，因此深受人们喜爱。草莓在各种浆果中，全球栽培面积和产量均位居前列。近年来，国内草莓产业发展迅速，草莓栽培面积也在不断扩大。良好的发展前景为草莓遗传育种工作带来新的机遇。

长久以来，草莓育种者已经利用常规育种方法培育了許多优良草莓品种。随着草莓产业的迅速发展，生产上对优质草莓种苗的需求不断增加，同时为适应国际市场，不同类型草莓品种的需求也在不断增长。常规育种方法往往由于育种周期长以及大量的人力物力消耗等原因而无法满足日益增长的草莓生产发展需要。近些年现代生物技术的兴起为目前植物遗传育种工作带来了新的前景，同时已显示出巨大潜力。生物技术在草莓遗传育种上的应用发展与其他主要作物相比进展较慢，但随着先进技术的不断涌现，生物技术对草莓遗传育种工作起到了显著的推动作用，同时也取得了一定的成绩。笔者主要概述了目前现代生物技术在草莓遗传育种中的应用与研究进展，探讨生物技术应用于植物遗传育种工作的发展方向。

1 组织培养与草莓遗传育种

草莓组织培养研究较早，茎尖、叶片、花药、原生质体等组织器官培养方面的研究均比较全面，因此组织培养将成为草莓品种改良的一种重要措施。尽管草莓组培苗在生产上的应用越来越广泛，但是近年来多项研究表明，组培效应会导致草莓组培苗发生体细胞无性系变异。Morozova[1]研究表明，草莓的离体培养和再生植株会发生形态学、细胞学和遗传物质等方面的变异。张馨宇等[2]发现草莓组培苗繁殖的匍匐茎子苗数量显著高于普通苗并且后代在结果期生长势较强，产量增加，但抗病性会有所下降，这种变异被认为是一种表观遗传变异。因此组培诱导的这些变异具有两重性，一方面将影响生产上用苗的品种一致性以及果实产量与质量，而另一方面也为草莓的种质创新及新品种的选育创造了一个新的途径。组培诱导效应引起植物变异的机理至今还不是很清晰，加强这方面的理论研究对今后的草莓遗传育种工作具有重要的创新意义。

1.1 草莓茎尖、叶片、花瓣培养

草莓茎尖培养是进行草莓种苗脱毒的主要方法。草莓匍匐茎的茎尖是较为方便且常用的取材部位，茎尖和分生组织培养在遗传与形态上较其他部位稳定[3]，而且更容易再生，适于大量扩繁。近些年很多研究者对草莓茎尖培养的培养基选择及培养方式等方面进行了较为全面的研究[4-5]，这为草莓组培苗应用于生产及工厂化育苗提供了一定的理論基础。草莓叶片、花瓣等器官培养可以通过诱导草莓离体器官再生获得稳定的草莓再生体系，从而获得大量的植物材料，为后续遗传转化与新品种选育工作奠定基础。董莉等[6]以草莓组培苗叶片为试材建立了‘红颜草莓叶片高效再生体系。顾地周等[7]通过诱导深山草莓花瓣愈伤组织获得了再生植株，并证明在适当激素和浓度配比条件下可诱导产生稳定性状变异植株。

1.2 草莓子房、花药与小孢子培养

人工诱导草莓单倍体植株可以通过未受精子房离体培养以及花药或小孢子培养2种方式获得。单倍体诱导对于植物倍性育种具有重要的意义，可以有效缩短育种年限。王文和等[8]研究证明离体培养草莓未受精子房获得单倍体植株的关键在于试材的选择、激素与蔗糖浓度以及温度的控制。赵永钦等[9]通过对草莓花药培养中预处理方式、花序以及激素种类和配比对愈伤组织形成的影响研究，探索了以草莓花药培养获得单倍体植株的最适培养条件。王萌[10]对野生草莓游离小孢子进行培养，研究了草莓游离小孢子培养的影响因素并获得了小孢子发育而来的胚状体，这是对草莓游离小孢子培养体系的首次探索。

1.3 草莓原生质体培养

原生质体培养在植物遗传转化、克服远缘杂交障碍、分离和纯化突变体等方面起到重要作用，这也是草莓育种的一种重要方法。张学英等[11]对草莓原生质体分离过程中的多项影响因素进行了深入研究，探讨了草莓原生质体分离时最佳的分离材料、酶液组成、酶解方式及时间等控制条件，为草莓的原生质体培养和融合等方面研究提供了很有价值的理论基础。冯颖等[12]将长白山区东方草莓和安娜草莓的原生质体融合并培养获得了属间体细胞融合的新植株，这证明了草莓原生质体培养与融合应用于草莓育种的可行性。

2 分子标记与草莓遗传育种

分子标记即一种遗传标记，实质上是能直接反映基因组DNA间差异的DNA片段，其可以反映生物个体以及种群间基因组中的某种差异。分子标记主要可以分为以分子杂交为基础的分子标记、以PCR为基础的分子标记、以DNA芯片和测序为基础的分子标记3类。DNA分子标记与细胞学标记、形态标记、生化标记等相比，具有显著优越性，因此DNA分子标记已被广泛应用于多种植物基因组作图、基因定位、基因克隆等遗传育种工作。在近些年草莓遗传育种工作中，分子标记技术在遗传图谱构建、抗病性辅助选择育种等方面起到了突出作用。

2.1 基于分子杂交的分子标记

RFLP是最早应用于遗传研究的分子标记，其以Southern杂交为基础，但其成本较高，技术难度较大。在RFLP的基础上，设计限制性内切酶及PCR引物可将其转化为成本适宜且易于操作的PCR-RFLP标记（即CAPS标记），这样更利于分子图谱构建及分子育种研究。Kunihisa等[13]成功开发出了可以对不同草莓品种进行有效区分的PCR-RFLP标记，这对育种者权利保护起到重要作用。此外，GISH与FISH技术也是以分子杂交为基础的。翁天均[14]首次利用FISH与GISH技术对原产中国以及其他国家地区的48份材料进行了系统分类、亲缘关系和多倍体形成等方面的分析与研究，这为草莓属植物系统分类与进化以及多倍体来源研究提供了重要参考依据。马鸿翔等[15]利用GISH对黄毛草莓×凤梨草莓杂种F1的五倍体植株进行检测，从而对黄毛草莓与凤梨草莓的种间杂交真实性进行了证实。

2.2 基于PCR的分子标记

基于PCR的分子标记是种类最多的一类，包括RAPD、AFLP、SSR、SCAR等。近年来这一类型的分子标记研究最为广泛。朱海生等[16]利用RAPD分析了不同继代次数草莓组培苗遗传稳定性。韩柏明等[17]利用基于AFLP的一种甲基化敏感扩增多态性标记（MSAP）分析了草莓组培苗基因组DNA甲基化程度与DNA甲基化模式的变异。因此分子标记可在草莓遗传稳定性研究中起到重要作用。王志刚等[18]曾以RAPD和SCAR标记为基础对草莓品种进行鉴定。Yoon等[19]利用SSR标记分析了不同来源栽培草莓的遗传多样性及群体构成。Isobe等[20]利用从已公布的草莓基因序列中收集的4474个SSR标记构建了一套综合完整的草莓基因连锁图谱，这对草莓遗传信息分析具有重要意义。曹娴等[21]利用SSR分子标记技术分别获得了与草莓灰霉病抗性基因连锁的SSR分子标记，而李静等[22]利用SSR建立了草莓抗炭疽病遗传图谱。这说明分子标记可应用于草莓抗病辅助选择育种实践。

2.3 基于DNA芯片和测序的分子标记

SNP是在动植物体内均广泛存在的遗传标记。SNP在遗传变异连锁作图、关联分析、群体分析等遗传育种工作中具有重要意义，但由于其以芯片技术与测序为基础，成本消耗高，因此在多数植物研究中还未得到普及。目前，部分研究者已将SNP标记利用到草莓研究当中。Ge等[23]通过比较16种栽培于南京的草莓品种的EST序列，发现了116个SNP位点并用这些SNP多态性标记进行了系统进化分析，说明SNP标记可作为品种鉴定与遗传多样性分析的强大工具。野生二倍体草莓F. vesca基因组的公布[24]以及其他草莓种类的基因组数据的不断更新将有效加快草莓SNP的预测与确认过程，这将对目前栽培草莓的起源与异源多倍体构成等方面的研究有极大的促进作用[25]。

3 基因工程与草莓遗传育种

植物基因工程是在分子生物学与分子遗传学等综合学科基础上建立起来的以植物基因结构功能研究、新品种选育与品种改良等为主要目标的一种现代生物技术。尽管转基因技术在有关食品安全以及生态平衡等方面仍存在诸多争议，但这一技术在理论研究以及部分物种品种选育与改良上已经取得很多成果。基因工程技术在草莓上的应用也渐趋广泛。通过基因工程手段可以验证草莓基因功能，缩短草莓育种周期，进行品种遗传性状的定向改良，有效提高育种效率。

3.1 农杆菌介导的叶盘转化法

植物遗传转化有多种方法，例如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等。在草莓遗传转化方面应用最为广泛的方法是农杆菌介导的叶盘转化法。近年来，国内外许多研究者利用农杆菌介导法进行草莓转基因研究，同时在抗虫害、抗病毒与真菌、抗逆性、抗除草剂等诸多方向上获得转基因植株[26]，开辟了新的草莓育种途径。但是这种方法存在一定的缺陷，主要体现在这种方法受较多因素的影响，其转化效率较低。Husaini[27]就曾对农杆菌介导的草莓微繁殖苗转化过程进行深入研究，其认为培养时间和筛选条件等对转化率有较大影响。Pantazis等[28]研究了一种在森林草莓上快捷高效筛选鉴定转化植株的方法，其利用一种转入Ac/Ds转座子标签系统的农杆菌进行草莓转化，并在拟转化植株移栽后进行巴龙霉素喷雾试验的方法，可以对转化植株进行快速筛选鉴定。

3.2 RNAi技术

RNAi又称基因沉默，是一种应用于基因研究的新技术。该技术可以在基因表达、调控与功能研究以及植物品种品质改良中起到重要作用，为反向遗传学研究提供了一条新的便捷途径。近年来，RNAi技术在草莓基因功能与品质改良方面的研究逐渐增多。Muňoz等[29]应用RNAi技术证明了Fra a（一种编码草莓过敏原蛋白的基因）在草莓类黄酮生物合成途径中具有重要作用。Lin等[30]通过沉默FaDFR基因使得草莓果实颜色变浅，证明FaDFR基因是草莓果实花青素生物合成途径中的关键基因之一。同时，以RNAi理论为基础而出现的VIGS（病毒诱导的基因沉默）也在草莓研究中得到应用。Jia等[31]利用VIGS技术使FaNCED1以及一种ABA受体基因FaCHLH表达下调均能使草莓果实无法转红，但外源ABA处理能够恢复FaNCED1下调的果实的着色却不能使FaCHLH下调的果实颜色得到恢复，从而验证了ABA在果实成熟调控过程中起到重要作用。这都为草莓果实色素形成机理及品质改良提供一定理论依据。

4 展望

综上所述，现代生物技术在草莓遗传育种研究中得到广泛应用并取得一定进展。随着生物技术方法的不断创新，尤其是基因组学、转录组学以及蛋白组学等方面研究的不断深入，现代生物技术将逐渐成为植物遗传育种与品种改良的一种重要手段。但这些技术仍然存在一定的局限性，仍需大量深入研究而弥补缺陷。这主要体现在以下几点：（1）组培诱导的草莓遗传变异机理尚不明确，尤其是表观遗传变异机理研究仍需进一步深入探讨。（2）分子标记在草莓上的应用仍落后与其他多年生果树，大多集中于质量性状研究。（3）草莓遗传转化效率低，稳定性差，并且基因工程技术仍存在一定风险，转基因安全性尚需深入研究。

因此，现代生物技术尚难取代常规育种技术在草莓遗传育种中的地位，但是若将现代生物技术与常规育种技术有效结合，比如利用新技术加快种质创新与鉴定，加强分子标记辅助选择在常规育种中的应用，建立安全、稳定、高效的草莓遗传转化体系等，这将有效促进草莓抗病、抗逆、优质、丰产、耐储等育种目标的实现，为草莓产业发展创造更多机遇。

参考文献

[1] Morozova T. Genetic stability of pure line of （Fragaria vesca L.） in micro-propagated and long term storage in vitro[J]. Acta Horticulturae，2003，567：85-88.

[2] 张馨宇，张志宏，高秀岩，等.草莓微繁殖苗及其后代性状表观遗传变异研究[J].果树学报，2006，23（4）：542-546.

[3] Debnath S C. Propagation Strategies and Genetic Fidelity in Strawberries[J]. International Journal of Fruit Science，2013，13（1-2）：3-18.

[4] 朴日子，曹后男，宗成文.影响“达赛莱克特”草莓茎尖培养因素的研究[J].延边大学农学学报，2009，31（3）：184-188.

[5] 王燕，陳丙义，章镇，高志红，等.黄毛草莓组织培养与快繁技术研究[J].西南农业学报，2012（1）：252-256.

[6] 董莉，晁慧娟，董清华，等.红颜草莓叶片再生体系的建立[J].中国农学通报，2010，26（10）：246-249.

[7] 顾地周，朱俊义，冯颖，等.深山草莓花瓣离体诱导变异株系及其品种特性[J].中国农学通报，2010，26（20）：27-32.

[8] 王文和，吴禄平，赵玉萍，等.草莓未受精子房离体雌核发育的研究[J].园艺学报，2011，38（8）：1455-1461.

[9] 赵永钦，吴新新，郑禾，等.草莓‘甜查理和‘章姬花药培养及单倍体植株的获得[J].中国农业大学学报，2012，17（5）：39-45.

[10] 王萌.草莓小孢子培养与离体诱导染色体加倍研究[D].南京：南京农业大学，2011.

[11] 张学英，葛会波，刘艳萌，等.草莓原生质体分离条件的研究[J].分子植物育种，2006，4（6）：147-152.

[12] 冯颖，顾地周，朱俊义，等.草莓属间体细胞融合研究[J].江苏农业科学，2013，41（3）：29-31.

[13] Kunihisa M， Matsumoto S. Discrimination of strawberry varieties by a DNA analysis[J]. Agriculture and Horticulture，2004，79（1）：180-184.

[14] 翁天均.基于45SrDNA-FISH與GISH分析的草莓属（Fragaria）野生种亲缘关系与系统分类研究[D].重庆：西南大学，2011.

[15] 马鸿翔，陈佩度，余桂红，等.利用GISH和RAPD检测黄毛草莓×凤梨草莓种间杂种[J].植物遗传资源学报，2005（3）：256-261.

[16] 朱海生，李永平，林珲，等.草莓品种的亲缘关系及其不同继代次数的叶片组培苗的RAPD分析[J].核农学报，2010，24（2）：264-268.

[17] 韩柏明，赵恺，李贺，等.组织培养导致的草莓DNA甲基化变异[J].植物生理学通讯，2010（8）：797-802.

[18] 王志刚，张志宏，李贺，等.利用RAPD和SCAR标记鉴定草莓品种[J].园艺学报，2007，34（3）：591-596.

[19] Yoon M Y， Moe K T， Kim D Y， et al. Genetic diversity and population structure analysis of strawberry （Fragaria × ananassa Duch.） using SSR markers[J]. Electronic Journal of Biotechnology，2012，15（2）：6.

[20] Isobe S N， Hirakawa H， Sato S， et al. Construction of an Integrated High Density Simple Sequence Repeat Linkage Map in Cultivated Strawberry （Fragaria × ananassa） and its Applicability[J]. DNA research，2013，20（1）：79-92.

[21] 曹娴，高清华，聂京涛，等.草莓灰霉病抗性遗传分析和分子标记初定位[J].上海交通大学学报：农业科学版，2011（4）：18.

[22] 李静，高志红，段可，等.草莓抗炭疽病遗传图谱及其QTL初分析[J].核农学报，2012，26（2）：250-256.

[23] Ge A J， Han J， Li X D， et al. Characterization of SNPs in strawberry cultivars in China[J]. Genetics and molecular research，2013，12（1）：639.

[24] Shulaev V， Sargent D J， Crowhurst R N， et al. The genome of woodland strawberry （Fragaria vesca）[J]. Nature genetics，2010，43（2）：109-116.

[25] Kaur S， Francki M G， Forster J W. Identification， characterization and interpretation of single-nucleotide sequence variation in allopolyploid crop species[J]. Plant biotechnology journal，2012，10（2）：125-138.

[26] 秦永华，张上隆.草莓转基因研究进展[J].遗传，2007，29（2）：150-156.

[27] Husaini A M. Pre-and post-agroinfection strategies for efficient leaf disk transformation and regeneration of transgenic strawberry plants[J]. Plant cell reports，2010，29（1）：97-110.

[28] Pantazis C J， Fisk S， Mills K， et al. Development of an efficient transformation method by Agrobacterium tumefaciens and high throughput spray assay to identify transgenic plants for woodland strawberry （Fragaria vesca） using NPTII selection[J]. Plant cell reports，2013，32（3）：329-337.

[29] Mu?oz C， Hoffmann T， Escobar N M， et al. The strawberry fruit Fra a allergen functions in flavonoid biosynthesis[J]. Molecular plant，2010，3（1）：113-124.

[30] Lin X， Xiao M， Luo Y， et al. The effect of RNAi-induced silencing of FaDFR on anthocyanin metabolism in strawberry Fragaria × ananassa fruit[J]. Scientia Horticulturae，2013，160：123-128.

[31] Jia H F， Chai Y M， Li C L， et al. Abscisic acid plays an important role in the regulation of strawberry fruit ripening[J]. Plant Physiology，2011，157（1）：188-199.