禽蛋卵黄抗体检测中影响血凝抑制试验结果的因素分析

庄金秋等

摘 要：血凝抑制试验是检测有血凝性的家禽疾病抗体效价最常用的一种方法，具有简便、快速、灵敏、准确等特点，已被广泛应用于各兽医检测机构和基层养禽场，但是由于试验操作过程中的不规范操作和细节注意不够，导致不正确检测结果出现的现象时有发生，笔者结合工作实践现将禽蛋卵黄抗体检测过程中影响血凝抑制试验结果的影响因素进行分析归纳总结，以期能对生产应用提供参考。

关键词：卵黄抗体；血凝抑制试验；检测；影响因素

母鸡被特定抗原免疫后，产生的特异性抗体除主要以IgG的形式存在于血清中，还可以储存在卵黄中，被称为卵黄抗体（IgY）。研究表明，新城疫或禽流感疫苗二免21d后（在有基础免疫的情况下）卵黄抗体水平与血清抗体水平接近，卵黄抗体水平的大小直接反映了血清抗体水平的高低。在蛋禽疾病防治中，为了及时掌握禽流感、新城疫、产蛋下降综合征等疫苗的免疫效果，了解产蛋家禽抗体水平的高低以便制定正确的免疫程序，临床上需要对免疫家禽的卵黄抗体水平进行多次监测。这在一定程度上避免了因采血测定血清抗体给家禽造成的应激反应，不致引起家禽产蛋量的下降。应用血凝抑制试验（HI试验）检测禽蛋卵黄抗体水平是最简便、经济、准确的血清学检测方法。但在实际操作过程中，由于种种原因，常有检测结果不准确或试验失败的现象发生，造成不能及时向送检单位及时提供检验数据，进而给蛋鸡生产但来不必要的损失。笔者结合工作实践现将禽蛋卵黄抗体检测过程中影响血凝抑制试验结果的影响因素分析归纳总结如下，以期为临床抗体检测工作者提供参考。

1 试剂的配制与贮存

1.1 抗凝剂 抗凝剂可选用阿氏液或3.8%的枸橼酸钠（柠檬酸钠）。阿氏液含有枸橼酸钠和细胞需要的养分葡萄糖，配制方法为：称取葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.8g，柠檬酸0.055g，氯化钠0.42g，加超纯水至100ml，加热溶解后将pH值调到6.1，经116℃、20min的高压灭菌，于4℃保存备用。阿氏液pH过低会引起红细胞凝固。3.8%的枸橼酸钠配制简单，高压灭菌后同样置于4℃保存备用。

1.2 稀释液 常用的稀释液为灭菌的磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH7.2 PBS）和生理盐水（0.85%NaCl溶液），其pH值应控制在7.0～7.2。PBS对其它酸碱物质具有较强的缓冲能力，可以维持反应体系的酸碱度，提高试验的准确性。病毒的血凝性一般在pH4.5～7.8较稳定，最适pH范围为6.0～7.2。PBS的pH在5.8以下，红细胞易自凝；pH在7.8以上，吸附于红细胞上的病毒易脱落，导致凝集图像不稳定，容易消失，对照有可能不成立；而pH为7.0时红细胞沉淀最充分，图形最清晰，红细胞对照成立，出现的结果易判读。PBS尽可能现用现配，保存时间过长，pH会发生变化。采用生理盐水做稀释液时，生理盐水应无菌、无杂质，自制的生理盐水pH值应保持在7.0，如有偏差，可用磷酸二氢钾调节。盐浓度亦不能过高，否则NaCl在一定浓度时会发生盐类凝集现象。用PBS做稀释液比生理盐水测出的抗体效价要高，可提高检出率。如果试验结果要求严格，尽量不要使用生理盐水，因为生理盐水不具备酸碱缓冲能力。

1.3 1%红细胞悬液

1.3.1 红细胞的宿主来源 同种禽血清或卵黄抗体与不同种禽红细胞之间会出现非特异性凝集，有时会掩盖特异性抗体血凝抑制，导致试验结果出现假阴性。如用鸡红细胞检测水禽禽流感抗体时就可能会出现非特异性凝集现象，而用水禽红细胞检测同种水禽的禽流感血清抗体，则可以有效去除血清非特异性凝集的影响，且能更准确地反映疫苗接种后水禽体内的抗体水平。因此，试验中应尽可能选择与宿主来源相同的红细胞悬液检测家禽抗体水平。

1.3.2 红细胞的宿主要求 来源于不同个体的红细胞对病毒的敏感程度会有所不同，有的个体红细胞有自凝现象，从而影响HI效价，所以配制鸡红细胞最好选取2～4只健康、未经过疫苗免疫的成年SPF公鸡的混合红细胞。条件不足的可选用无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡。另外大型养鸡场淘汰的健康公鸡，在专用的饲养室饲养6个月左右，确保体内的禽流感和新城疫等抗体水平降低后也可采用。如果用免疫公鸡代替SPF公鸡，在洗涤红细胞时须增加洗涤次数和时间，否则将影响红细胞的敏感性。

1.3.3 红细胞的采集和制备 采血前先将注射器内吸入3.8%枸橼酸钠（1份抗凝剂可抗凝4份血液）或阿氏液（抗凝剂和血液等体积）再翅下静脉采血。采完后将注射器反复颠倒几次以充分混匀，防止血液凝固。将所采鸡血注入大离心管，加入PBS液或新鲜生理盐水混匀，1500～2000r/min离心10min，重复洗涤3～5次，每次离心后用灭菌吸管吸弃掉上清液和白细胞层，保留红细胞层。对于免疫状况不明的鸡全血，最少洗涤5次，以减少血液中抗体对试验结果的影响。最后一次洗涤离心后，吸去上清液，沿管底部吸取一定量的红细胞泥用稀释液稀释成1%的红细胞悬液，置4℃可保存3～5d。

要控制好配制的红细胞浓度，因为随红细胞浓度增加，血凝（HA）滴度下降，HI滴度有所上升，而且红细胞的浓度越高，出现结果的时间越短。配好的红细胞悬液要进行标定：取红细胞悬液60ml，自然沉淀后，吸弃稀释液50ml，混匀后装入刻度离心管内，以10000r/min离心5min，红细胞压积应为6%，否则应适当调整标定。红细胞要做沉淀检查：取96孔V型板一块，滴一滴红细胞悬液到任意孔内，室温静置20～40min，查看血细胞沉淀情况，决定是否能用。要想长期保存可使用红细胞醛化法：将离心处理好的红细胞加入8倍量体积的冷至4℃的36%甲醛溶液混合均匀，置4℃作用24h，期间不断轻摇震荡；2000r/min离心10min，将红细胞加入2倍量体积的冷至4℃的30%甲醛溶液混匀，4℃作用24h，离心后红细胞用PBS液洗涤5次，最后配成0.75%醛化红细胞液，加入终浓度0.1%叠氮纳4℃备用。0.75%醛化红细胞悬液可完全替代1%新鲜红细胞，并可保存红细胞2个月以上。红细胞的洗涤和贮存很关键，如果红细胞没有洗净或保存不好，则会严重干扰试验结果，出现红细胞始终不沉淀或沉淀过快、部分凝集等。进行红细胞悬液配制吸取沉淀的红细胞时，要在离心管最底部吸取进行稀释配制，如随意从沉淀的红细胞上层吸取将会导致配制的红细胞悬液浓度偏低，因为最后一次离心洗涤红细胞后弃去的PBS液会有一些残留在沉淀的红细胞上层。注意红细胞在使用时一定要把沉积的红细胞吹散，充分混合均匀。另外，不可使用破裂溶血的红细胞进行试验。

2 试验前准备

2.1 V型微量反应板的选择 用于血凝抑制试验的微量血凝板一般分为一次性使用的聚苯乙烯塑料反应板和可重复使用的有机玻璃反应板（主要成分为聚甲基丙烯酸甲酯），每种又有96孔和72孔两种规格，按孔型又可分为V型和U型两种。V型具有更典型的凝集模型，U型有时比V型的血凝效价高1～2孔。有机反应板因清洗不净和过度磨损会影响试验结果，因此如果使用有机反应板的话，要注意清洗程序，一定要彻底清洗干净，磨损严重的有机反应板要及时淘汰，而使用一次性塑料反应板能够避免清洗不净和过度磨损而影响试验结果的问题。试验建议使用一次性96孔V型优质塑料反应板。使用一次性凝集板，要求试验前检查凝集板，剔除有漏洞、形状不规则、板面有褶皱、有接口、板面和板孔不干净、不光滑的凝集板。根据不同试验对反应板的要求进行选择，口蹄疫血凝试验要求110°V型反应板，而对新城疫、禽流感等的检测，国标中则无特定要求。有研究证实，禽流感血凝抑制试验中使用110°和90°两种V型血凝板，其检测结果无差异，可以任选一种进行试验。使用不合格的反应板会严重影响结果。反应板整包开封后，若一次使用不完，应保持包装完整，确保剩余反应板的清洁无磨损。

2.2 微量移液器、枪头和离心管的选择与准备 根据试验需要选择合适量程范围的8道、12道或单道微量移液器及相匹配的枪头，忌用大量程的移液器移取小体积样品，否则会影响移液器的准确性，枪头必须安装牢固，防止漏气和掉落。移液器吸取液体时遵循“缓吸快打”原则，使用时不要用力过猛，浸入液体深度要合适，不要过深，角度保持竖直为佳。移液前应先预湿枪头，按一档，停留片刻后缓慢平稳地吸取液体，绝不能突然松开，以防溶液吸入过快而冲入移液器内而产生气泡。排出样品时按二档彻底排出枪头内的液体。必要时可采用反向移液法，二档吸液，一档排液，将残余液体随枪头弃去，这种方法精确性更高。加样完毕，把移液器的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态，利于移液器的保养。使用一段时间后，要及时请微量移液器的生产厂家进行校正，避免产生错误或不精确的结果。

移液器尽量使用高质量的、一次性的枪头，经高压灭菌后备用。如果反复使用，在使用后应立即在消毒液中浸泡，然后经超声波清洗、高压灭菌后方可反复使用，使用3～5次后要及时淘汰，及时更新。如果质量不太好的话，在用多道移液器时一定要注意安装上枪头后管嘴能够并齐。枪头一定要与移液器上枪头套管密封完好，防止由于空气泄露而造成加样精度或准确度的误差。

离心管可选用1.5ml或2ml的一次性离心管，经高压灭菌后备用。

2.3 抗原和阳性血清的制备与贮存 抗原和阳性血清一般为冻干制品，应-20℃保存。在进行抗原效价的测定时，同一种抗原最好两瓶以上混合后使用，并做重复试验，取其平均值，减少误差。抗原的凝集价在外界不稳定，冷藏保存或反复冻融时其效价降低，因此应尽量减少反复冻融次数。测定好效价的抗原如果一次不能用完时应分装到灭菌离心管内，管上标注分装日期和效价，每管的分装量最好是一次使用量，避免反复冻融。每次试验前必须检测抗原的血凝价，以确定4单位抗原的配制。如果发现抗原效价过低则不能使用。

3 样品的采集和处理

3.1 鸡蛋的选择 如果检测禽群疫苗免疫后的的卵黄抗体水平，应随机抽取一定数量的各个禽群所产禽蛋，兼顾异常蛋与正常蛋。如果用于禽群疾病的检测，可选择异常蛋（白皮、软皮、畸形蛋，恢复期产的小蛋，濒死或死亡鸡剖检的变形卵泡）进行抗体检测。

3.2 卵黄抗体的提取 由于卵黄萃取方法比直接卵黄稀释所得检测结果更直观、准确且易于判断，因此建议采用氯仿萃取法提取禽蛋卵黄抗体。将收集的禽蛋应用75%酒精消毒蛋壳后，打开蛋壳弃去蛋清，用1ml注射器（去掉针头）或者1ml枪头（适当减掉头部少许）插入蛋黄内部吸取0.4ml蛋黄，置入预先准备好的装有0.4ml PBS的2ml离心管并充分混匀，混合后每管加入0.8ml氯仿，置振荡器充分混匀后室温静置1h，然后4000r/min离心10min，溶液分为3层，吸取上清液备用或置4℃保存（氯仿体积不计，待检样品按被稀释2倍计算）。

4 4个血凝单位（HAU）抗原的制备与贮存

4.1 血凝试验 配制4HAU抗原前需先对抗原做血凝试验，以抗原与红细胞完全凝集的最高稀释孔作为抗原效价。应按照国标进行HA试验操作。先在96孔微量板每排1～12孔内加25μl，每种抗原至少加3排，然后在每排第1孔加入25μl准备好的抗原液，弃掉枪头后，换新枪头进行1～11孔的倍比稀释，第11孔稀释完后吸取25μl弃掉，第12孔为细胞对照。为确保配置好的4HAU与HI试验结果吻合，需每孔补加25μl稀释液，然后再加入充分混匀的25μl 1%的红细胞悬液，确保每孔总体积与HI试验相一致为75μl。置振荡器震荡，室温静置20～30min或2～8℃ 40min后观察结果。有时候抗原效价较高，测定4单位抗原时第11孔显示完全血凝，出现这种情况时，不能断定抗原血凝单位，根据经验应该将抗原倍比稀释度继续多稀释2～3个孔，以出现完全凝集的最高稀释倍数代表1个血凝单位，从而获得4单位抗原效价。

4.2 4HAU抗原的配制与贮存 根据血凝试验结果，将其除以4作为抗原稀释倍数，配制4HAU抗原并充分混匀。为防止4单位抗原配制不准确，在HI试验前必须做抗原回滴验证，方法同HA试验，要求稀释的第1孔、第2孔的红细胞完全凝集，而第3孔、第4孔部分凝集（红细胞在孔壁凝成一红圈而不是均匀的凝集）或不凝集，即第2孔为完全凝集的终点，则说明配制的4单位抗原没有问题，可以使用。也可先在微量反应板的1～4孔分别加入稀释液25、50、75、100μl，然后在每孔各加入4单位抗原25μl并充分混匀。另取1排反应孔，第1孔加入4单位抗原液25μl，第2～5孔分别加入上述稀释好的1～4孔内的抗原液各25μl，6～7孔分别加入25μl稀释液作红细胞对照，最后吸取1%红细胞悬液25μl依次加入1～7孔中，置振荡器震荡，室温静置20～30min或2～8℃ 40min后观察结果。若第1、2、3孔完全凝集，第4、5孔不完全凝集，第6～7孔完全沉淀，则表明配制的4单位抗原准确，否则需重新测定抗原效价。重新配制4个HAU抗原并做回归试验，直至结果准确。4个HAU抗原要现用现配，混悬液要混匀，不能长时间存放，也不可反复冻融。配好的抗原室温下放置不要超过4h，特别是在夏天气温高时，抗原容易失效。如检验样品过多，4单位抗原添加时间较长最好放在冰上进行操作，以免抗原失效。4单位抗原即工作抗原的准确制备是HI试验过程中的重要环节，在HI试验中至关重要，抗原效价测定不准确对试验结果影响很大。过高，测定的抗体效价降低；过低，测定的抗体效价升高。为了得到准确的抗原效价，建议试验中同时进行多排测定，取平均滴度作为抗原的最终效价。

5 血凝抑制试验操作与结果判定

5.1 HI试验 4单位抗原配制并验证好后，可进行禽蛋卵黄抗体的HI检测。取96孔微量反应板，按照需要现在每排第2～12孔各加入25μl稀释液，然后在每排第1孔和第2孔各加入25μl被检抽提好的卵黄抗体上清液，从每排第2孔开始倍比稀释直到第10孔，第10孔稀释完后吸取25μl弃掉，这样稀释的卵黄抗体浓度为10-1～10-10，第11孔作为抗原对照，第12孔作为稀释液对照。另设1排1～11孔倍比稀释的阳性血清对照。被检禽蛋卵黄抗体样品和对照阳性血清加完后，微量板每排1～11孔各加入25μl配置好并充分混匀的4单位抗原，最后一排加入25μl稀释液，将微量板置震荡器，充分震荡1min后室温放置20～30min。最后取反应板，每孔加入25μl配置好并充分混匀的1%红细胞悬液，充分震荡后室温放置20～30min或2～8℃ 40min后，观察结果并读数。

5.2 结果判定 结果判定时，以完全抑制4单位抗原的卵黄抗体最高稀释倍数作为HI效价。将微量反应板倾斜45°，孔底沉淀的红细胞流动性好，呈泪滴样流淌，边缘无凝集颗粒者为凝集完全抑制。泪滴长度可参照稀释液对照孔，与稀释液对照孔泪滴长度相同的孔为完全抑制孔。如果泪滴样流淌线较细，可能是反应时间不够，需静置一段时间再判读。泪滴长度会随时间变化，所以判断时应迅速。在判定结果时，首先要观察对照是否成立。HI试验对照成立的条件是：阳性血清对照孔误差不超过1个滴度，4单位抗原对照完全凝集，稀释液对照完全不凝集。只有在对照成立的条件下试验结果才有效，否则需要重检。卵黄抗体样品HI效价小于或是等于3log2判定HI试验阴性；等于4log2为可疑，需重复试验；大于或等于5log2为阳性。读结果的具体时间要根据实际情况而定，不要一味的按照国标所规定的时间来，温度对实验结果的显示有一定的影响，在等待结果时不要频繁的翻动反应板。读结果时不宜时间过长，否则将影响结果的显示与判定。环境温度对结果的出现影响很大。温度过低，出现结果要慢；环境温度过高，超过30℃时，试验结果出现得要快，一旦时间过长，结果就会消失，使整板无凝集现象。另外，不要将反应板放置于风扇、空调或风机出风口，以免液体挥发较快，影响试验结果。

6 小结

综上所述，在血凝抑制试验中，影响试验结果的因素很多，只有严格遵守各项操作规程，耐心细致地做好每一个环节，同时综合考虑各方面的因素，发现问题及时纠正处理，才能保证试验结果的准确，从而准确评价鸡群免疫的效果。