利用甘蔗尾叶复合甘蔗糖蜜酒精发酵液生产腐植酸的研究

李楠 周瑞芳 邓智年 辛明 张娥珍

摘要

[目的]优化利用甘蔗尾叶复合甘蔗糖蜜酒精发酵液生产腐植酸工艺。[方法]以甘蔗尾叶和甘蔗糖蜜酒精发酵液为原料，通过白腐真菌、巨大芽孢杆菌、绿色木酶3种微生物混合发酵生产腐植酸，利用单因素试验及正交试验确定了此3种微生物混合发酵的最佳工艺条件。[结果]试验得出3种微生物混合发酵的最佳工艺条件：最适培养时间6 d，最佳甘蔗糖蜜酒精发酵液锤度为18°Bx、初始pH为6.0，温度31 ℃，最優液料比为3∶1 ml/g，白腐真菌、巨大芽孢杆菌、绿色木酶3种菌最佳比例1∶1∶2，总接种量12%。其中发酵时间对腐植酸含量有显著性影响，在最优条件下的腐植酸含量为15.61%，较优化前提高了45.48%。[结论]研究充分利用了甘蔗尾叶及甘蔗糖蜜酒精发酵液中的营养物质，获得了生物活性高的生化腐植酸产品，其环境效益、经济效益及社会效益显著，具有广阔的的发展前景。

关键词 甘蔗尾叶；甘蔗糖蜜酒精发酵液；混合发酵；腐植酸；发酵条件优化

中图分类号 S566.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）26-09153-04

Study on Producing Humic Acid with Sugarcane Caudate Lobe and Sugarcane Molasses Alcohol Fermentation Broth

LI Nan， ZHANG E-zhen et al

（College of Life Science and Technology， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004； Institute of Agro-products Processing， Guangxi Academy of Agricultural sciences， Nanning， Guangxi 530007）

Abstract [Objective] To study on producing humic acid with sugarcane caudate lobe and sugarcane molasses alcohol fermentation broth. [Method] With sugarcane caudate lobe and sugarcane molasses alcohol fermentation broth as raw material， humic acid was produced by mixed fermentation of white-rot fungi， Bacillus megaterium and Trichoderma reesei. Using single-factor test and orthogonal test， the optimal technique conditions were determined. [Result] The optimal conditions are： time 6 d， 31 ℃， 18 °Bx and pH 6.0 of sugarcane molasses alcohol fermentation broth， liquid-material ratio 3， the proportion of inoculation was 1∶1∶2， total inoculum size 12%， and the fermentation time had a significant effect on the content of humic acid. In the above optimal conditions， HA content reached 15.61%， and increased by 45.48% than before optimization. [Conclusion] The nutrient materials in sugarcane caudate lobe and sugarcane molasses alcohol fermentation broth were utilized to obtain biochemical humic acid product with high biological activity， which has significant environment， economic and social benefits， as well as broad development prospect.

Key words Sugarcane caudate lobe； Sugarcane molasses alcohol fermentation broth； Mixed fermentation； Humic acid； Optimization of the fermentation conditions

目前甘蔗种植面积最大的国家是巴西，其次是印度，我国位居第三，而广西占全国甘蔗种植面积的63%^[1]。甘蔗收割季节，甘蔗尾叶除部分作为牛羊青料喂养外，大部分被蔗农焚烧在蔗地，由此会造成环境污染和肥力流失。甘蔗糖蜜酒精发酵液是制糖工业中的残留物——甘蔗糖蜜进行酒精发酵后产生的酱酒色、高浓度酸性的有机废水^[2]，是制糖工业最为严重的污染源^[3]。它排放量大、颜色深、酸度大、营养丰富、成分复杂，若不加利用而直接排入水体中，不仅浪费了资源，而且对环境污染十分严重^[4]。

腐植酸（Humic Acid，简称HA）是由死亡的动植物遗骸在水分和空气存在的条件下经长期微生物分解、转化及地球物理化学作用后生成的复杂无定形高分子化合物^[5]。它含有羧基、羟基、醇羟基、醌基、羰基、甲氧基等多种活性基团，具有弱酸性、亲水性、络合性、胶体吸附性、螯合性等特性^[6]，其应用已经渗透到工、农、医等各个领域。腐植酸一般从泥炭、风化煤中提取得到，近年来发酵法生产腐植酸产品是研究开发的热点。发酵法生产腐植酸是模拟天然腐植酸的生成过程，将特定的微生物接种到培养基中，通过微生物发酵而制取腐植酸的过程^[7]，其腐植酸产品与普通矿源腐植酸相比，具有更高比例的官能团、分子量小、生物活性高、水溶性好、抗硬水能力强等优点，与此同时，还含有多种有益微生物种群^[8]。

笔者以农业废弃物甘蔗尾叶及甘蔗糖蜜酒精发酵液为原料，通过微生物混合发酵生产腐植酸作为有机肥，既充分利用了甘蔗尾叶及甘蔗糖蜜酒精发酵液中的营养物质，减轻了对环境的污染，又获得了生物活性高的生化腐植酸产品，其环境效益、经济效益及社会效益显著，具有广阔的发展前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

菌株来源。白腐真菌、巨大芽孢杆菌、绿色木霉，广西大学食品发酵研究所保藏。

1.1.2

发酵原料来源。甘蔗尾叶：广西农业科学院武鸣实验基地实验田种植的甘蔗。甘蔗糖蜜酒精发酵液：广西南宁糖业股份有限公司。

1.1.3

培养基。

1.1.3.1

斜面培养基。综合马铃薯培养基：20%马铃薯汁1 L，葡萄糖20.0 g，KH₂PO₄3.0 g，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，硫胺素8.0 mg，琼脂20.0 g，pH 6.5。营养肉汁琼脂培养基：蛋白胨5.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 000 ml，pH 7.0～7.2。

1.1.3.2

摇瓶培养基。综合马铃薯液体培养基：20%马铃薯汁1 L，葡萄糖20.0 g，KH₂PO₄3.0 g，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，硫胺素8.0 mg， pH 6.5。營养肉汁培养基：蛋白胨5.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 ml，pH 7.0～7.2。

1.1.3.3

发酵培养基。甘蔗尾叶干燥粉碎后过20目筛，取6.0 g置于250 ml三角瓶内，以4∶1 ml/g的液料比添加锤度12°Bx、pH 6.0的甘蔗糖蜜酒精发酵液，混合均匀后121 ℃灭菌20 min。

1.1.4

主要仪器。XT-200型高速多功能粉碎机，浙江永康红太阳机电有限公司；METTLER TOLEDO 320 pH计；METTLER TOLEDO PL303 精密电子天平，德国METTLER公司；SPX-250恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；SKY-211B振荡培养箱，上海苏坤公司等仪器。

1.2 方法

1.2.1

初始发酵培养及后续发酵条件优化。以12°Bx、pH 6.0的甘蔗糖蜜酒精发酵液作为初始发酵培养基原料之一。初始发酵情况简述：甘蔗尾叶干燥粉碎后过20目筛，取6.0 g置于250 ml三角瓶内，以4∶1 ml/g的液料比添加锤度12°Bx、pH 6.0的甘蔗糖蜜酒精发酵液，白腐真菌、巨大芽孢杆菌、绿色木酶3种菌初始接种比例选取1∶1∶1、总接种量为10%，28 ℃下培养。依次考察发酵时间、糖蜜酒精发酵液浓度及初始pH、发酵培养基液料比、发酵温度、3种菌接种比例及总接种量对腐植酸产量的影响。根据单因素试验结果，设计正交试验，探索较佳的发酵工艺参数。

1.2.2

腐植酸含量的测定方法。

目前，腐植酸含量的测定方法主要有容量法和重量法^[9]。容量法理论上是测定样品中的HA所含的碳^[10]，由于该试验发酵原料甘蔗糖蜜酒精发酵液中含有大量的残糖、色素，这些物质都将在测定过程中对实际结果产生干扰，因此，该试验中腐植酸含量的测定方法不宜选用容量法。而重量法是以腐植酸不溶于酸但可溶于碱为依据进行提取测定，过程中不存在容量法的缺点，实际测定值较准确，因而该研究采用重量法来进行腐植酸含量的测定。参照黄金凤等的腐植酸提取的操作流程^[11]，用1% NaOH溶液来提取发酵样品中的腐植酸，然后用重量法测定腐植酸含量。

2 结果与分析

2.1 发酵时间对发酵产品中腐植酸含量的影响

为确定后续试验的发酵周期，分别发酵2、4、6、8、10 d后进行腐植酸含量测定。图1显示了腐植酸含量在发酵过程中随时间的变化情况。发酵初期，腐植酸含量增长较快，是由于培养基中大量的营养物质被利用进而转化为有机酸类物质；当发酵时间为6 d时，腐植酸含量达到最大值10.73%，培养时间超过6 d后，腐植酸产量逐渐有所下降。因此，发酵时间选择6 d较佳。

2.2 甘蔗糖蜜酒精发酵液锤度对发酵产品中腐植酸含量的影响

甘蔗糖蜜酒精发酵液成分复杂，含有大量的有机物，其中碳源、氮源和无机盐离子种类丰富，能够提供微生物生长代谢所需要的营养物质。由于微生物在其生长代谢过程中不仅需要合适的碳源、氮源、无机盐离子种类，同时还需要合适的碳源、氮源及无机盐离子浓度。将甘蔗糖蜜酒精发酵液稀释成不同锤度后配制培养基，不仅可以改变培养基中碳源、氮源、无机盐离子等营养物质的浓度，而且也改变了培养基的黏稠度和通气性，进而对微生物的生长和产物的合成产生一定的影响。为确定培养基中甘蔗糖蜜酒精发酵液的适宜浓度，将调至10、12、14、16、18、20、22°Bx的甘蔗糖蜜酒精发酵液分别配制发酵培养基，发酵6 d后，测定腐植酸的含量。如图2所示，在甘蔗糖蜜酒精发酵液的锤度为18 °Bx时，发酵产品中腐植酸的含量最大。因此，甘蔗糖蜜酒精发酵液的锤度选择18°Bx较好。

2.3 甘蔗糖蜜酒精发酵液初始pH对发酵产品中腐植酸含量的影响

由于氢离子与细胞膜上的酶相互作用，发酵培养基中的pH将对微生物细胞膜通透性、各种酶的活性、底物结合等方面产生影响，因此合适的pH环境必将有利于微生物的生长代谢。为确定该试验中微生物所需的较佳pH环境，将初始pH调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的甘蔗糖蜜酒精发酵液分别配制发酵培养基，发酵6 d后，测定腐植酸的含量。如图3所示，当初始pH为6.0时，腐植酸含量最高，所以甘蔗糖蜜酒精发酵液初始pH选取6.0较适宜。

2.4 液料比对发酵产品中腐植酸含量的影响

由于甘蔗糖蜜酒精发酵液中含有碳源、氮源、无机盐离子等微生物生长代谢所需要的营养物质，因而液料配比将对发酵培养基中的碳源、氮源、无机盐离子等营养物质含量产生直接影响。同时，液料配比也会对培养基的物理状态产生影响，液体比例越小，基质越干燥，空隙较多，通气性越好；反之则越接近流体，在静置培养的条件下，通气性较差。为确定培养基中较为合适的液料比，将初始发酵培养基的液料比分别调至2.5∶1、3.0∶1、3.5∶1、4.0∶1、4.5∶1、5.0∶1 ml/g，发酵6 d后，测定腐植酸的含量。如图4所示，当初始发酵培养基液料比为3.0∶1 ml/g时，腐植酸含量最高，故初始发酵培养基液料比选择3.0∶1 ml/g较好。

2.5 发酵温度对发酵产品中腐植酸含量的影响

由于微生物的生长及其代谢产物的合成都是在各种酶的催化作用下进行的，培养温度对酶活力大小产生直接影响，进而影响到微生物的生长及其代谢，所以适宜的培养温度于微生物而言十分重要。为确定较佳的发酵温度，分别在22、25、28、31、34 ℃温度下进行试验，发酵后分别测定发酵产品中腐植酸含量。试验结果如图5所示，随着培养温度升高，腐植酸的含量也随着增加，当培养温度超过28 ℃时，温度越高，腐植酸含量反而降低。因此，培养温度选择28 ℃较为合适。

2.6 菌種比例对发酵产品中腐植酸含量的影响

该研究是以甘蔗尾叶和甘蔗糖蜜酒精发酵液为原料，通过白腐真菌、巨大芽孢杆菌、绿色木酶3种微生物混合发酵生产腐植酸。由于3种菌作用各不相同，因而选取适宜的接种比例不仅有利于对培养基中营养物质的吸收利用，而且有利于所需代谢产物的生成。在总接种量一定的条件下，将白腐真菌、巨大芽孢杆菌、绿色木酶3种微生物按不同的比例接种。试验结果如图6所示，在白腐真菌、巨大芽孢杆菌、绿色木酶3种菌比例为1∶1∶2时，腐植酸含量最大。因此，3种菌比例选择1∶1∶2较佳。

2.8 发酵条件正交试验结果

通过上述单因素试验，初步确定了以甘蔗尾叶和甘蔗糖蜜酒精发酵液为原料，通过白腐真菌、巨大芽孢杆菌、绿色木酶3种微生物混合发酵生产腐植酸的最优条件。为了进一步确定各因素的最优组合，以单因素试验为依据，对发酵时间、发酵温度、液料比3个因素进行正交试验，其他条件均保持单因素优化确定的最优条件。正交试验因素水平设计见表1。

根据正交试验结果（表2）和方差分析（FA=36.757>F0.05=19.000；FB=8.781C>B，即发酵时间>液料比>发酵温度，3个因素最佳条件组合为A₂C₂B₃。即3种菌接种到液料配比为3.0∶1 ml/g的发酵培养基中，在31 ℃培养6 d的条件下，腐植酸含量最高。在该条件下的验证性试验结果表明，在此组合的条件下，腐植酸含量最高为15.61%，较优化前提高了45.48%。因此该试验选择此3个因素的最佳组合为发酵时间6 d、发酵温度31 ℃、液料比3.0∶1 ml/g。

3 结论

通过单因素试验及正交试验确定了此3种微生物混合发酵的最佳工艺条件：最适培养时间6 d，最佳甘蔗糖蜜酒精发酵液锤度为18°Bx、初始pH为6.0，温度31 ℃，最优液料比为3.0∶1 ml/g，白腐真菌、巨大芽孢杆菌、绿色木酶3种菌最佳比例1∶1∶2，总接种量12%。其中发酵时间对腐植酸含量有显著性影响。在最优条件下的腐植酸含量为15.61%，较优化前提高了45.48%。

该试验以甘蔗尾叶及甘蔗糖蜜酒精发酵液为原料，通过微生物混合发酵生产具有广泛用途的腐植酸，不仅促进了甘蔗尾叶及甘蔗糖蜜酒精发酵液废弃资源的循环再利用，而且亦为农业有机废弃物资源化、功能化及综合利用提供了参考，实现了由过去的“资源—产品—废弃物”的物质单向流动向“资源—产品—废弃物—再生资源”循环式经济模式的转变，生态环境效益和经济效益显著，具有广阔的发展前景。

参考文献

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