SSR分子标记在大豆原原种提纯中的应用

曲忠诚

摘要 选用生产上应用的5个大豆品种为材料，利用分布在16个基因连锁群的多态性SSR引物进行PCR扩增，经6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行带型分析。供试材料通过分子鉴定，均存在混杂现象，去除混杂株行后，将带型一致的株行进行繁殖，从而获得纯度较高的原原种。研究结果表明，利用SSR分子标记对大豆原原种进行提纯，不仅能够去除形态学上的差异种子，还能够将形态特点极为相似的混杂种子去除。

关键词 分子标记；大豆；原原种；提纯

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）26-08887-03

Application of SSR Markers in Soybean Original Seed Purification

QU Zhong-cheng

（Qiqihaer Sub-academy of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Qiqihaer， Heilongjiang 161006）

Abstract This study selected 5 soybean varieties used in production as material， using PCR amplified polymorphic SSR primers distributed on 16 linkage groups， through 6% polyacrylamide gel electrophoresis， for banding analysis. The tested materials by molecular identification， there are mixed phenomenon， after removal of hybrid lines， the type of strains was reproduced， so as to obtain higher purity of the original seed. The results show that， the soybean seed was purified by using SSR molecular markers， not only can remove the difference of morphology on the seed， but also can remove other similar hybrid seeds.

Key words Molecular markers； Soybean； Pre-elite seed； Purification

從20世纪50年代开始，经过我国育种家的不懈努力，累积育成、推广大豆新品种1 500多个^[1]，这些新育成的大豆品种具有相对稳定的形态特征和生理特性，但经过一代代的生产繁殖，大部分大豆品种都会逐渐发生纯度降低、种性变劣等不良变异，因而导致一些品种失去了原本具有的形态特点和生理特性，抗逆性、产量和品质不断下降，并有混杂现象。这种混杂是在大豆生产繁殖过程中普遍存在的现象，育种家或种子生产者为防止品种混杂退化，通常会进行原原种繁殖，以便去除混杂植株。可见原原种提纯是大豆种子生产、繁殖过程中一个非常重要的环节。

在生产实践中，育种家及种子生产者通常做法是分辨原原种株行形态学上的差异来去除杂株，但这不仅无法去除形态特点极为相似的混杂种子，并费时费工，且受环境条件影响较大。随着DNA分子标记和检测技术的日趋完善，利用SSR为共显性分子标记的特点，可以快速、准确地鉴定不同大豆品种基因型^[2-4]。

目前，利用SSR标记鉴定杂交种纯度已广泛用于玉米、水稻、油菜、棉花、番茄等作物中，佘花娣等^[5]阐述了利用 DNA指纹技术进行品种鉴定的原理、特点及其研究概况，认为DNA指纹技术可以鉴定表型上难于鉴别的作物品种^[6]。该标记具有多态性高、数量丰富、简便快速、稳定性高、重复性好、不受环境影响等优点，能够反映DNA水平上品种个体间的遗传差异。该技术是纯度种子鉴定的最适宜技术之一，可广泛应用于植物分子标记连锁图的构建与基因定位、遗传关系分析、种质及其纯度鉴定等方面。

针对育种和原原种繁殖过程中，种子提纯不仅费时费工，且无法去除混杂形态相似种子的现象，笔者主要通过材料间广泛多态性的SSR引物，对原原种单株进行分子检测，去除混杂单株，以达到原原种提纯的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

利用5份参试的大豆品种500个株行进行分析，分别设代号A、B、C、D和E，均为黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院提供。田间收获时，每份材料选取100株单株，每株单独脱粒，单独存放并编号为A001、A002…等，以此类推。

1.2 方法

1.2.1 总DNA 提取与SSR分析。

参照中华人民共和国农业行业标准大豆品种纯度鉴定技术规程分子标记法（NY/T 1788-2009）进行分析。每份材料取100粒种子，每粒种子编号，反脐方向取等量组织混合制样。试验取少量放入1.5 ml离心管中，加入700 μl预热（60 ℃）的SDS提取液倒置几次，在60 ℃下水浴60 min，中间颠倒混匀3次。取出后在室温下10 000 r/min离心15 min，加700 μl 24∶1（V/V）的氯仿∶酚溶液，倒置几次轻轻混匀，室温下10 000 r/min离心15 min。去上清液转移至1.5 ml离心管中，加入700 μl 24∶1（V/V）氯仿∶酚重新抽提一次，室温下8 000 r/min离心15 min。加700 μl异丙醇（-20 ℃）静置15 min，8 000 r/min离心5 min去上清。用75%乙醇洗涤沉淀2次，吹干后用200 μl超纯水溶解。采用1%琼脂糖电泳检测DNA浓度。

1.2.2 SSR引物来源。

根据Cregan大豆公共遗传图谱，分别在20条染色体连锁群上随机选择覆盖全基因组的SSR引物，经筛选选取16个连锁群上扩增稳定、多态性高的15对SSR引物进行试验，采用上海生物工程有限公司合成的SSR引物序列。

1.2.3 SSR引物筛选及扩增。

利用筛选的15对引物，对5组共500份材料进行SSR分子标记分析。

PCR扩增反应体系含1×的PCR缓冲液，150 μmol/L引物（包括上游引物和下游引物），250 μmol/L dNTPs，150 μl 10×buffer，1 U Taq聚合酶，30 ng总DNA，用超纯水补足15 μl。

PCR反应在T-Gradient进行，扩增条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，47 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，20个循环；72 ℃延伸5 min，于4 ℃下保存。

电泳方法：每个SSR体系加1.5 μl甲酰胺双色Loading Buffer（在PCR板上），置于PCR仪中变性5 min，然后放入冰水混合物中冷却。PCR产物在6%的聚丙烯酰胺标准测序胶上分离，采用北京六一厂DYIII-88A型电泳槽，功率为恒定100 W，电泳时长约1 h。

银染方法：0.2% AgNO₃中染色20 min（避光），去离子水漂洗30 s，用10%冰醋酸固定液定影5 min，清水漂洗2 min，照相。

2 结果与分析

2.1 分子标记的多态性分析

利用筛选的15对引物对全部材料进行分子标记扩增，获得清晰的电泳谱带。品种B 100份株行中，B1～B50样本中Satt503位点存在差异的电泳谱带见图1，共有5个株行存在差异。B51～B100样本中Satt503位点无差异。

3 讨论

大豆在育种和繁殖过程中，利用种子或植株的外观特性来鉴别不同个体的方法虽然较直观、简便，但可直接观测的农艺性状有限，且受外界环境的影响较大，不利于种子繁殖和提纯工作的开展。随着分子生物学应用的日趋广泛，利用分子标记技术在种子纯度鉴定方面的研究結果表明，SSR是一种可用于种子纯度鉴定的简便技术。

该研究选用多态性指数较高的15对SSR引物进行电泳扩增，对大豆原原种进行提纯，不仅能够去除形态学上有差异的种子，还能够将形态特点极为相似的混杂种子去除。随着更多SSR位点的开发及SSR检测技术的进步与普及，这一技术将在原原种提纯中得到广泛应用。

4 结论

该研究选用筛选出株行间具有多态性的SSR引物对5个生产上应用的大豆品种进行PCR扩增，经6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行带型分析，获得原原种的纯度，并将带型一致的株行进行繁殖，从而获得纯度较高的原原种。结果表明，供试品种均存在混杂现象，利用SSR分子标记去除混杂单株，不仅能够去除形态学上有差异的种子，还能够将形态特点极为相似的混杂种子去除。该方法检测快速，不受环境影响，且省时省力。

参考文献

[1] GAO Y L，ZHU R S，LIU C Y，et al.Establishment of Molecular ID in Soybean Varieties in Heilongjiang，China[J].Acta Agron Sin，2009，35（2）：211-218.

[2] 张芳，谢皓，陈学珍.大豆分子标记辅助育种研究进展[J].北京农学院学报，2010，25（2）：73-77.

[3] RUSSELL J R，FULLER J D，MACAULAU M，et al.Direct Comparison of levels of genetic variation among barley accessions detected by RFLPs，AFLPs，SSRs and RAPDs[J].Theor Appl Genet，1997，9：714-722.

[4] POWELL W M，MORGANTE J J，DOYLE J W，et al.Genepool variation in genus Glycine subgenus soja revealed by polymer phicnuclear and chloroplast microsatellites[J].Genetics，1996，144：793-803.

[5] RUSSELL J R，FULLER J D，MACAULAU M，et al.Powell W，Waugh R.Direct Comparison of levels of genetic variation among barley accessions detected by RFLPs，AFLPs，SSRs and RAPDs[J].Theor Appl Genet，1997，9：714-722.

[6] SHE H D，CHEN J T，HUANG Y Q，et al.Progress on variety identification of crop using DNA fingerprinting[J].J Agric Univ Hebei，2003，26（S1）：28-32.