大孔吸附树脂纯化丹酚酸B的工艺研究

张翠英 章洪 王阶

摘要[目的]利用大孔吸附树脂优化丹参中高纯度丹酚酸B的纯化工艺。[方法]大孔吸附树脂纯化考察包括树脂类型的选择、上样量、除杂溶剂、洗脱溶剂等多方面因素。[结果]确定丹参中丹酚酸B的纯化树脂为大孔吸附树脂HP300、上样量为1∶2（丹参∶树脂）、2 BV水除杂、3 BV的40%乙醇洗脱。收集40%乙醇洗脱部分回收溶剂喷雾干燥，丹酚酸B纯化物中丹酚酸B的含量为73.6%、68.9%。[结论]大孔吸附树脂优化的纯化条件为丹酚酸B进一步研究开发奠定了实验基础。

关键词丹参；丹酚酸B；纯化；大孔吸附树脂

中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）23-07752-02

基金项目国家自然科学基金（81202932）；国家科技重大专项（2013ZX09301307）。

作者简介张翠英（1972- ），女，辽宁喀左人，副研究员，博士，从事中药药效成分的研究。*通讯作者，主任医师，博士生导师，从事心血管临床研究。

收稿日期20140707丹酚酸B是丹参（唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎）中含量最高的水溶性有效成分，大量的药理研究表明丹酚酸B具有较强的抗氧化、保护心肌和缺血再灌注损伤等作用[1-3]，在心脑血管疾病方面具有明确稳定的疗效。该试验是在前期研究的基础上[4]，筛选纯化丹酚酸B的大孔吸附树脂，优选大孔吸附树脂纯化丹酚酸B的纯化工艺条件，为相关丹酚酸B制剂的开发应用奠定实验基础。

1材料与方法

1.1仪器Agilent 1200型高效液相色谱仪，配置四元梯度泵、在线脱气机、DAD检测器（安捷伦公司）；METTLER AB135S电子天平（瑞士）。HZS4水浴振荡器（哈尔滨市东联电子科技开发有限公司），B600B型台式低速离心机（北京白洋医用离心机有限责任公司），超纯水系统（Millipore，USA）。

1.2材料大孔吸附树脂HPD100、HPD300、HPD400、HPD400A、HPD450、HPD500、HPD600、HPD700、D101、AB-8、DM130购自河北沧州宝恩吸附材料科技有限公司。丹酚酸B对照品（批号11071331，上海同田生物技术有限公司），乙腈（色谱纯，美国FISHER公司），冰醋酸（分析纯，北京化工厂），乙醇（医用乙醇）。丹参饮片购于中国中医科学院广安门医院药房，标示为北京丰泰金源药业有限公司（批号12120602，产地山东），经张翠英副研究员鉴定为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎加工成的饮片。

1.3试验方法

1.3.1色谱条件。Agilent TCC18 BDS（250×4.6 mm， 5 μm）色谱柱。流动相为乙腈 （A）1%醋酸（B），梯度洗脱分别为0～5 min、12%～20%A，5～10 min、20%～22%A；10～13 min、22%A，13～25 min、22%～30%A，25～35 min、30%～65%A，均为线性洗脱；流速为1.0 ml/min；检测波长286 nm；柱温35 ℃。

1.3.2标准贮备液的配制。精密称取丹酚酸B对照品适量（5.74 mg）置10 ml棕色量瓶中，加75%甲醇配制成丹酚酸B对照品贮备溶液（0.574 mg/ml）。

1.3.3标准方程的建立。精密吸取贮备溶液适量分别配制成一系列浓度的对照品溶液（11.48、22.97、57.42、114.84、229.69、574.22 μg/ml），分别进样5 μl，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标进行线性回归。

1.3.4丹酚酸B的含量测定。精密吸取样品液或洗脱液进行适当稀释，经0.45 μm滤膜过滤后进样检测，根据标准曲线计算丹酚酸B的含量。

1.3.5树脂的预处理。选择处理好的大孔吸附树脂HPD100、HPD300、HPD400、HPD400A、HPD450、HPD500、HPD600、HPD700、D101、AB-8适量，按照大孔吸附树脂的用前处理方法，用乙醇浸泡4 h以上，上柱用乙醇冲洗，冲洗至无白色混浊物，流出液与水以1∶1的比例混合后仍澄清，再用水洗至无醇味。

1.3.6静态吸附筛选树脂。分别称取5 g，置于锥形瓶中，分别加入已知丹酚酸B含量的丹参水提浓缩液100 ml，水浴恒温（30 ℃）振摇（50转/min）24 h；吸附后的溶液过滤，采用“1.3.1色谱条件”测定，计算每种树脂的吸附量。同时将每种吸附丹参水提液的大孔吸附树脂分别用不同比例的乙醇溶液（水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇）依次洗脱，采用HPLC法测定洗脱液中丹酚酸B的含量。

1.3.7根据动态吸附优选树脂。分别称取预处理好的大孔吸附树脂HPD300和AB8适量，装入玻璃层析柱（内径1.5 cm），精密吸取丹参水提浓缩液45 ml上样，每5 ml流出液取样一次，HPLC法测定丹酚酸B含量，根据流出液体积和丹酚酸B的渗出量绘制吸附曲线。

1.3.8根据洗脱情况优选树脂。分别用水、5%、10%、30%、40%、50%、70%乙醇進行洗脱，根据丹酚酸B的含量优选除杂容剂和最佳洗脱溶剂。

1.3.9水提液上样量的优化。取大孔吸附树脂HPD300各5 g装入3根层析柱，精密吸取丹参不同体积的水提浓缩液上样，先用2 BV水除杂，再分别用40%乙醇5 BV洗脱，每1 BV洗脱液收集一次，HPLC法测定洗脱液中丹酚酸B的含量，计算大孔吸附树脂HPD300对丹酚酸B渗漏和洗脱情况，确定丹参药材和树脂的最佳比例。

1.3.10丹酚酸B纯化物的放大试验。取2批丹参饮片按条件水提[4]，提取液浓缩上大孔吸附树脂HPD300，用2 BV水除杂，再用3 BV的40%乙醇洗脱，洗脱液浓缩，喷雾干燥得丹酚酸B的纯化物，测定纯化物中丹酚酸B的含量。

2结果与分析

2.1标准方程的建立以丹酚酸B的峰面积为纵坐标、浓度为横坐标进行线性回归，结果表明，丹酚酸B在11.48～574.22 μg/ml范围内线性关系良好，其回归方程为Y=2.80X-10.37（r=0.999 9）。

2.2静态吸附筛选树脂比较分析各大孔吸附树脂的静态吸附量（）发现，HPD300、HPD400A、HPD600、HPD700、D101、AB8型号大孔吸附树脂的吸附量比较高，结合洗脱情况可见，HPD300和AB8型号大孔吸附树脂吸附的丹酚酸B易于洗脱，所以初步选择这2种树脂进行动态情况考察筛选树脂。

10种树脂静态吸附及洗脱情况

树脂型号吸附量

2.3根据动态吸附优选树脂根据流出液体积和丹酚酸B的渗出量绘制大孔吸附树脂HPD300和AB8的吸附曲线，从可以看出，大孔吸附树脂HPD300的渗漏明显小于AB8。大孔吸附树脂AB8（a）和HPD300（b）的动态吸附曲线2.4根据洗脱情况优选树脂水作为除杂溶剂较好，含有乙醇的溶剂不适合作为除杂溶剂，5%乙醇就可以造成2%丹酚酸B的损失，故选择2 BV的水除去水溶性杂质；40%乙醇是最佳的洗脱溶剂，3 BV 40%乙醇能洗脱出85%以上的丹酚酸B（）。大孔吸附树脂AB8（a）和HPD300（b）的40%乙醇洗脱曲线2.5确定纯化树脂根据试验结果计算HPD300和AB8