反相高效液相色谱法同时测定金银花中的绿原酸和木犀草苷方法的优化

刘文静 潘葳 涂杰峰 杨继伟

摘要 [目的]研究反相高效液相色谱法同时测定金银花中的绿原酸和木犀草苷的优化色谱条件。[方法]采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）同時测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量，并对色谱条件进行优化。[结果]最佳色谱条件为色谱柱Waters SunFireTMC18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）、柱温40 ℃，流动相为乙腈-0.5%冰醋酸，梯度洗脱为0～15 min（10∶90～20∶80）、16～17 min（20∶80～10∶90），流速1.0 ml/min，检测波长0～15 min 328 nm、16 ～17 min 350 nm。[结论]优化后缩短了测试时间，为金银花质量的快速检测提供参考依据。

关键词 反相高效液相色谱法；金银花；绿原酸；木犀草苷；优化

中图分类号 S567 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）26-08948-03

Optimization of the Determination Method of the Chlorogenic Acid and Luteolin-7-O-glucoside in Flos Lonicerae by RP-HPLC

LIU Wen-jing， PAN Wei et al （Central Laboratory， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003；Fujian Key Laboraotory of Precision Measurement of Agriculture， Fuzhou， Fujian 350003）

Abstract [Objective] The research aimed to study the optimal chromatographic conditions of the deter mination method of the chlorogenic acid and luteolin-7-O-glucoside in flos lonicerae by RP-HPLC. [Method] A RP-HPLC method with UV detector was established and optimized to deter mine the chlorogenic acid and luteolin-7-O-glucoside in Flos Lonicerae. [Result] The chromatographic conditions were： Waters SunFireTMC18 （4.6 mm× 250 mm， 3.5 μm） used for column（at 40 ℃）with 0.5% acetic-acetonitrile.Linear gradient elution： 0-15 min（10∶90～20∶80），16-17 min（20∶80～10∶90）， flow rate ：1 ml/ min， deterction wavelength：0-15 min 328 nm，16-17 min 350 nm. [Conclusion] After optimization， the test time was shortened.The study provides the reference for deter mination method of rapid detection of flos lonicerae quality.

Key words RP-HPLC；Flos lonicerae；Chlorogenic acid；Luteolin-7-O-glucoside；Optimization

金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥后的花蕾或初开的花，是我国常用的清热解毒传统中药，其味甘、性寒，具有清热解毒、疏风散热之功效^[1]。金银花中主要活性成分为绿原酸以及木犀草苷为代表的黄酮类成分^[2]，目前对金银花中绿原酸和木犀草苷的含量的测定主要是以高效液相色谱（HPLC）为主^[3-7]，但大部分方法测试分析时间相对较长，增加了检测工作量；且色谱峰不易分开，峰形分离度也不理想^[8]。该试验建立高效液相转换波长法，同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量，通过优化色谱条件，以期更为简单快速的检测这2种有效成分的含量，为金银花质量的快速检测分析提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料 金银花由福建省科技厅农牧业科研中试中心提供。

1.2 仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列（PDA）检测器，Waters Empower色谱工作站，MILLIPORE超纯水器，中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司），超声波清洗器KQ-250DB （昆山市超声仪器有限公司），离心机Microfuge UV（美国贝克曼库尔特有限公司），电子分析天平AL24（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），微量可调移液器（eppendorf）。

1.3 试剂及其配制

乙腈色谱纯，无水乙醇、冰醋酸为优级纯，绿原酸（Sigma，纯度≥98%，美国），木犀草苷（Sigma，纯度≥98%，美国），所有试验用水为超纯水（蒸馏水再经过Millipore超纯水系统制备）。

1.3.1 70%乙醇水溶液。移取无水乙醇700 ml，用超纯水稀释并定容至1 000 ml。

1.3.2 0.5% 醋酸溶液。移取冰醋酸5 ml，用超纯水稀释并定容至1 000 ml，然后用0.45 μm孔径的水相滤膜过滤，再经超声脱气，即为流动相B，过滤乙腈为流动相A。

1.3.3 标准储备溶液的配制。精密称取绿原酸0.018 5 g，用70%乙醇水溶液定容至10 ml， 制成浓度为1.81 mg/ml標准溶液，精密称取木犀草苷0.020 6 g用70%乙醇水溶液定容至50 ml，制成浓度为0.404 mg/ml标准溶液，置于4 ℃冰箱备用。

1.3.4 标准工作液的配制。取上述储备液各1.0 ml于同一10 ml棕色容量瓶中，用70%乙醇水定容，制成绿原酸浓度181 μg/ml和木犀草苷浓度40.4 μg/ml的混合工作液1。取上述储备液各1.0 ml于同一100 ml棕色容量瓶中，用70%乙醇水定容，制成绿原酸浓度18.1 μg/ml和木犀草苷浓度4.04 μg/ml的混合工作液2。

1.4 样品前处理

金银花样品经60 ℃烘干，粉碎，过40目筛。称取0.5 g于50 ml棕色容量瓶中，用70%乙醇水溶液定容，摇匀，超声提取30 min，过滤。取一定量的滤液，10 000 r/min高速离心10 min，分离沉淀干扰物质，取上清液用0.45 μm孔径的滤膜过滤，滤液供上机分析，分析时进样10 μl。

1.5 色谱条件的优化

1.5.1 流速。

使用色谱柱Waters SunFireTMC18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），柱温40 ℃，比较了不同流速（0.8、1.0、1.2 ml/min）对绿原酸和木犀草苷分离情况的影响。

1.5.2 流动相。

色谱柱选择Waters SunFireTMC18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），柱温40 ℃，流速为1.0 ml/min，考察3种流动相梯度变化对绿原酸和木犀草苷分离情况的影响：①0～10 min（10%～25%A）、11～20 min（25%～10%A）；②0～15 min（10%～20%A）、16～20 min （20%～10%A）；③0～10 min（10%～15%A）、11～20 min（15%～10%A）。

1.5.3 检测波长。采用二极管阵列检测器在210～400 nm范围采集紫外吸收光谱图，检测对绿原酸和木犀草苷的最大吸收波长。

1.6 检测效果分析

以最佳的色谱条件测定几种金银花中绿原酸和木犀草苷的含量，并分析测试方法线性范围、精密度、稳定性、重复性和回收率。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化确定

2.1.1 流速确定。

绿原酸随着流速增加出峰提前，分离度影响不大，木犀草苷在1.0 ml/min分离效果最好。流速低分离时间较长，杂质不易分离，流速增大则会增加系统的压力，效率低。该试验通过比较发现，流速为1.0 ml/min时，系统压力适中，灵敏度也足够高，所以该方法确定流速为1.0 ml/min。

2.1.2 流动相确定。试验结果表明（图1），选择“1.5.2”中第1种梯度变化作为流动相时，因乙腈有机相占比例较大，样品出峰较快，木犀草苷与前面杂质不能完全分离；而选择第3种梯度变化因水相占比例较大，样品出峰慢，木犀草苷与后面杂质峰不能完全分离，而绿原酸在有机相比例较大时出峰较快，水相增大时出峰保留时间延长，考虑木犀草苷的分离情况故选择第2种流动相，因木犀草苷在15 min左右出峰，故不需设置20 min，最终流动相为0～15 min（10%～20%A）、16～17 min （20%～10%A）。

2.1.3 波长确定。

检测结果（图2）显示，绿原酸在325.7 nm处有最大吸收值，考虑到仪器的稳定性，故选定检测波长为328 nm；木犀草苷在348.4 nm处有最大吸收值，故选定检测波长为350 nm。

3 讨论与结论

（1）此试验绿原酸和木犀草苷含量测定方法参照《中国药典》2010年版一部，按照药典的梯度洗脱程序，木犀草苷与相邻杂质峰分离不好，无法得到较好的色谱峰，导致测定结果偏大。该试验通过设置不同检测条件，保证绿原酸较快出峰的前提下，使木犀草苷能与相邻杂质峰分离干净，目标峰形较好，与杂质峰达到基线分离。

（2）采用HPLC法测定金银花中绿原酸和木犀草苷已有较多报道，但测定时间普遍较长，一般均需25 min以上^[5-7]， 增加了检测工作量，该试验通过优化色谱条件，能够在较短时间内（16 min左右）得到理想的结果，缩短了检测时间。

（3）用该方法中金银花中绿原酸和木犀草苷的回收率均大于96.0%，RSD值小于1%，回收率和重现性均可满足定量分析要求。该试验建立的HPLC法检测金银花中2种成分的含量快速易行，可为金银花质量的快速检测分析提供一定的参考。

参考文献

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