人用狂犬病疫苗中β—丙内酯残留量的检测

刘辉等

【摘 要】 目的：检测人用狂犬病疫苗中BPL的残留量。方法：采用气相色谱法检测BPL含量，确定最低检出限，并分析BPL在37℃条件下的水解变化情况，检测人用狂犬病疫苗中的β-丙内酯的残留量。结果：气相色谱法检测BPL含量的灵敏度为8.96ppm，对人用狂犬病疫苗中的β-丙内酯进行检测，未发现残留。结论：气相色谱法检测BPL残留量的灵敏度较高，结果可靠，可用于人用狂犬病疫苗生产过程中BPL残留量的检测。

【关键词】 β-丙内酯（BPL） 气相色谱法 人用狂犬病疫苗

【中图分类号】 R446.1 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-8801（2014）03-0326-02

β-丙内酯（β-Propiolactone，BPL）又名羟基丙酸内酯，是一种杂环类化合物 （C3H4O2），沸点155℃，常温下为无色黏稠状有刺激气味的液体，对病毒具有很强的灭活作用，其灭活机制是作用于核酸，改变其结构以达到灭活目的，在不破坏病毒抗原的同时，又能保持病毒良好的免疫原性；BPL水解后为无毒性的人体脂肪代谢产物β-羟基丙酸，常用于病毒类疫苗特别是人用狂犬病疫苗的灭活。

但BPL是一种致癌物，对皮肤、黏膜及眼睛有刺激性，因此必须对疫苗中的BPL含量进行检测，确保其已被完全水解，保证疫苗的安全性。本文采用气相色谱法检测了BPL的残留量，并对人用狂犬病疫苗中是否有BPL残留进行了检测，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

Agilent 公司7890A气相色谱仪。

1.1.2 试剂

β-丙内酯，购自德国SERVA，浓度1.146 g/ml。

PBS缓冲液（pH7.6）；人用狂犬病疫苗原液（以β-丙内酯灭活，批号T-RB20130101，T-RB20130102，T-RB2013003），由成都生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 气相色谱法分析条件

毛细管色谱柱为Agilent DB-624；载气为氮气，流速5ml /min；气化室温度180℃；检测器温度250℃；柱温120℃；进样量0.5μl。

1.2.2 绘制标准曲线

BPL用PBS缓冲液（pH7.6）作1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000、1：256000、1：512000稀释，分别进样，进行气相色谱法测定。以BPL含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，同时以PBS缓冲液（pH7.6）作空白对照。

1.2.3 BPL重复性检测情况

BPL用PBS缓冲液（pH7.6）作1：4000稀释，进样6次，进行气相色谱法测定，考察BPL重复性检测情况。

1.2.4 BPL水解变化情况

BPL用PBS缓冲液（pH7.6）作1：4000稀释，37℃水浴水解，每隔30min抽样进行气相色谱法测定，检测BPL含量。

1.2.5 人用狂犬病疫苗原液中BPL水解情况检测

1.3 批人用狂犬病疫苗原液按1：4000比例加入BPL灭活，37℃水浴水解2h，抽样进行气相色谱法测定，检测BPL含量。

2 结果

2.1 标准曲线绘制

随着BPL稀释倍数的增加，色谱峰面积随之减小，当BPL稀释至1：512000

时，未检测出峰，结果见表1。空白对照无色谱峰出现。

根据1：128000稀释时的信噪比为2.9，确定本方法的最低检出限为8.96ppm，根据表1，以BPL含量为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线，发现峰面积与BPL 含量呈线性关系，Y = 0.0741X + 1.9015，R2 = 0.997，标准曲线见图1。

2.2 BPL重复性检测情况

BPL用PBS缓冲液（pH7.6）作1：4000稀释，进样6次，进行气相色谱法测定，BPL保留时间分别为：3.015min、3.018 min、3.016 min、3.011 min、3.009 min、3.011 min，RSD为0.12%；BPL峰面积分别为：25.9、25.5、25.3、26.1、24.9、25.7，RSD为1.68%；两者均小于2%，表明用气相色谱法检测BPL残留的重复性良好。BPL色谱图见图2。

2.3 BPL水解变化情况

BPL用PBS缓冲液（pH7.6）作1：4000稀释，37℃水浴水解后进样检测，用标准曲线计算BPL含量。结果显示，随着水解时间的延长，BPL含量逐渐降低，水解3.0h后降至最低检出限以下，见表2。

2.4 人用狂犬病疫苗原液中BPL水解情况

将3批人用狂犬病疫苗原液按1：4000比例加入BPL灭活后，37℃水浴水解2h，进行气相色谱分析。根据结果1和2，BPL的出峰时间为3.015min左右，人用狂犬病疫苗原液在该时间点无峰出现，未检测出BPL残留，说明疫苗原液中BPL已完全水解。见图3。

3 讨论

随着我国综合国力和人民生活水平的提高，人们对于医药产品尤其是应用于健康人群的疫苗产品的安全要求也越来越高。目前，国内大部分疫苗生产企业都使用BPL灭活狂犬病毒，对于疫苗的安全性评估，虽然有动物试验支持，但在生产过程中还应检测BPL的含量，确保BPL完全水解。由于气相色谱法检测灵敏度高，样品用量少，结果准确快速可靠，因此在生物学、医学、药物学、环境保护、临床化学等领域，已广泛应用于化学成分的定性定量分析。本文采用气相色谱法检测BPL的残留量，最低检测限可达到8.96ppm，用该方法检测人用狂犬病疫苗中BPL的含量，结果3批疫苗原液在BPL出峰处均无色谱峰出现，表明在37℃水浴水解2h后，原液中BPL已完全水解，无残留。该方法准确可靠，较好地解决了BPL残留量检测的问题，可用于狂犬病疫苗生产过程中BPL残留量的检测，确保疫苗的安全。

参考文献

[1]《中华人民共和国药典》. 2010版，三部。

[2] 徐英，魏然，姜英，等. 气相色谱法对轮状病毒疫苗中β-丙内酯测定的研究. 微生物学免疫学进展，2010，38（3）：21-23.

[3] 张玉慧，高春润，潘广域，等. Vero 细胞人用狂犬病疫苗中β-丙内酯残留量的检测. 中国生物制品学杂志，1998，11（3）：144.

[4] 杨健，高军，张庆义等. β-丙内酯含量气相色谱检测方法的建立及其水解情况分析. 中国生物制品学杂志. 2010， 23（3）：323-324，332.

[5] 刘兆文，李福安，钱浩. β-丙内酯在人用纯化地鼠肾细胞狂犬疫苗制备中的应用研究. 中国人兽共患病杂志. 1999， 15（6）：71-72

[6] 李福安，窦志勇，潘丽静. 狂犬疫苗滅活后β-丙内酯水解的最佳pH 值的选择. 中国公共卫生. 1999， 15（11）：964.

[7] M.O.Schmita-Masse， Analyse de La β-propiolactone Par chromatogphie gaz- liquide I.REcherche d'un reside de β-propiolactone dans le Vaccin antirabique PasteurⅡ. Etude de la courbe d'hydrolyse de La β-propiolactone ápH7.4， Journa l of Chromatoyraphy，70（1972）：128～134.

[8] 陈伟，李忠义，廖辉等. β-丙内酯在Vero细胞HFRS疫苗中的应用. 中国公共卫生. 2003，19（06）： 669-670.

作者简介：刘辉，男， 1980年11月3日生，汉族，四川成都人。现为四川大学生物治疗国家重点实验室2010级生物医学工程专业工程硕士，研究方向为：疫苗的设计、制备及规模化生产。

指导老师：叶琳，女，现为成都生物制品研究所有限责任公司研究员。