NSF对慢性肾衰模型大鼠微炎症状态相关细胞因子影响的实验研究

赵静等

【摘 要】目的： 研究NSF对5/6肾切除模型大鼠微炎症状态相关细胞因子的影响。方法 ：将SD大鼠72随机分为假手术组、模型组、阳性对照组、NSF组，实施5/6肾切除术建立大鼠慢性肾功衰模型；治疗组自二次术后第31天起给药，连续30天。检测大鼠血Urea、Crea，残余肾组织病理情况确定模型建立，检测微炎症状态相关细胞因子：血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的变化。结果： NSF组与模型组比较：Urea、Crea明显降低 （ P<0.05），肾脏病理改变较轻，血清TNF-α和IL-6的表达明显降低（P<0.05）。结论： NSF能通过下调5/6肾切除模型大鼠TNF-α和IL-6的表达，改善其微炎症状态，延缓慢性肾衰竭的发展。

【关键词】5/6肾切除模型；微炎症状态；血清肿瘤坏死因子α；白细胞介素6

【中图分类号】R285.5 【文献标识码】B 【文章编号】1004-7484（2014）04-2165-02

Experimental study on effect of NSF on micro inflammation state related cytokines of CRF model rats

ZHAO Jing1 LIU Weiwei1 LI Xueping1 ZHANG Baocheng1 MI Jun2 GAO Yongxiang1*

（1. Chengdu University of TCM， Chengdu， Sichuan 610075； 2. Nanshan Pharmaceutical Ltd. ， Chengdu， Sichuan 610041）

【Abstract】Objective：To research the effects of NSF on micro inflammation state related cytokines of CRF model rats induced by 5/6 nephrectomy. Methods： 72 SD rats were divided into sham-operated group， vehicle control group， positive control group and NSF groups. Chronic Renal Failure was induced by 5/6 nephrectomy. On the 31st day after the 2nd surgery， the positive control group and NSF groups were administrated for 30 days. The model was evaluated by the content of Urea， Crea in blood serum and renal excisional biopsy. The micro inflammation state related cytokines， such as TNF-α and IL-6 were observed. Results： Compared with vehicle control group， the content of Urea and Crea in NSF groups was significantly lower （P<0.05）， the renal pathological changes was milder， and the secretion of TNF-α and IL-6 was significantly decreased （P<0.05）. Conclusions： NSF could improve the micro inflammation state of CRF model rats， and slow the progression of CRF by down-regulating TNF-α and IL-6.

【Key words】5/6 nephrectomy model， micro inflammation state， TNF-α， IL-6

慢性腎衰竭（CFR）是各型原发或继发性肾脏疾病后期，以代谢产物和毒物潴留，水、电解质、酸碱平衡紊乱及某些内分泌功能异常为主要表现的临床综合征，是各种慢性肾脏疾病终末期的共同表现。其末期治疗常依靠维持性血液透析（mainteinance hemodialysis，MHD）或肾脏移植维持生命，给社会、家庭及患者带来沉重负担。但即使接受上述治疗，透析相关疾病和肾移植后免疫状态紊乱导致的相关疾病仍严重影响患者的长期生存。近年诸多研究发现[1] [2]，微炎症状态在MHD患者中普遍存并参与透析相关疾病发生，且微炎症状态在CFR 进展恶化中，也发挥重要作用，影响患者预后。中药地耳草具有保肝、抗菌、增强免疫作用，临床常应用于肝炎的治疗[3]，在肾功能衰竭患者的肾功改善方面也有临床报道[4] [5]。NSF是地耳草提取的有效成分提取物，本课题组前期研究显示NSF能延缓慢性肾衰的发展。为进一步研究NSF对CFR治疗作用及对微炎症状态的影响，探索其对慢性肾衰的防治机制，本研究通过建立5/6肾切除大鼠模型，选取微炎症状态相关细胞因子TNF-α和IL-6进行检测，观察药物对肾功能及微炎症状态的改善作用。

1 材料

1.1实验动物 雄性清洁级SD大鼠72只，体重（210±10）g，成都中医药大学实验动物研究中心提供。常规条件下饲养，自由饮水，普通饮食，适应性喂养7天。

1.2实验用药

NSF由成都南山药业有限公司提供，依照委托单位提供的供试品人临床拟用剂量（1.2g/人.日）为主要依据，按照体表面积换算成大鼠的等效剂量（人的体重按60kg计）。

金水宝胶囊，江西济成可信金水宝制品有限公司，批号，20111203，以临床人用量（0.33g/粒，18粒/人日）经体表面积转换成大鼠等效剂量作为本实验剂量。

1.3主要试剂与仪器

全自动生化分析仪：日立7180型；

显微镜：德国莱卡显微镜，德国莱卡病理图像分析系统 DM2000；

类标准胎牛血清：中美合资兰州民海生物工程有限公司 批号：20100424；

双抗100X：PAA-Strasse1.4061 Pasching .Austria 货号：P11-010 批号：P01010-1446；

免疫组化试剂盒：生产商：北京博奥森生物技术有限公司，批号： FP-0023；

2 方法

2.1模型制作 大鼠适应性喂养7天，称重，编号，随机分为4组，每组选取18只为假手术组，剩余54只采用5/6肾切除术制作大鼠肾衰模型。腹腔注射10%水合氯醛辅以乙醚麻醉大鼠，俯卧固定于手术台上，局部剪毛，左侧肋下脊直肌外侧皮肤常规消毒，无菌操作下，切开各层，暴露左肾，分离固定。切开左肾上下两极包膜，切除上下两极约单侧肾脏2/3，用明胶海绵压迫止血后缝合各层。腹腔注射青霉素预防感染。术后7天第二次手术，同样方法麻醉，切开右侧背部暴露右肾，结扎肾蒂，全切右肾。

2.2分组给药 手术操作后的大鼠随机分为3组，每组18只。分别为模型对照组、阳性对照组、NSF组。所有大鼠于二次手术后第31天开始灌胃给予相应药物：假手术组和模型对照组以0.5%CMC-Na溶液灌胃，1ml/100g.bw；阳性对照组：金水宝胶囊5.7mg/kg；NSF组：NSF120 mg/kg。连续给药30天。

2.3 标本收集 用完药后禁食12h，次日称重，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血。留取血清做生化检测及elisa检测。处死后，取大鼠残余肾脏组织，置于4%多聚甲醛中固定，备病理学观察。

2.4检测指标及方法

2.4.1一般情况观察 动态观察造模期间大鼠存活率、进食情况、精神状态、活动度、皮毛光泽度等。

2.4.2血清Urea、Crea 用药完成后，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血。留取血清，以全自动血生化分析仪检测Urea、Crea变化。

2.4.3肾脏组织病理 最后一次给药后次日，麻醉处死大鼠，取残余肾脏组织于4%多聚甲醛中固定，修块后经自动脱水机退水处理、包埋、切片，行HE染色，显微镜下观察肾脏病理改变。

2.4.4血清微炎症状态细胞因子TNF-α、IL-6检测最后一次给药后次日，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血。留取血清，采用ELISA法检测TNF-α、IL-6含量。

1.5统计学方法 计量资料以（ ±s）表示，用SPSS17.0统计分析软件进行非参数检验和单因素方差分析。

3 结果

3.1一般情况 实验期间，正常大鼠全部存活，饮食饮水正常，活动灵活，皮毛光泽。造模处理后各组大鼠均出现死亡，各组存活率分别为：模型组66.67%，阳性对照组55.56%，NSF组77.78%；造模后各组大鼠均出现不同程度进食饮水量下降，精神萎靡恶动，毛色发黄干枯，体态消瘦等。尤其以模型组最为严重，治疗后，阳性对照组和NSF组均较模型组有一定程度恢复，进食、活动均有增加。

3.2血清Urea、Crea 各组大鼠Urea、Crea增高，与假手术组相比，具有显著差异（p<0.05），表明造模成功；NSF组、阳性对照组与模型组比较Urea、Crea降低，有显著差异（p>0.05），表明NSF能降低血Urea、Crea的含量。（表1）

3.3肾脏病理变化 肉眼观察，造模后残余肾脏包膜增厚、变硬，表面粗糙部分区域有隆起，切面暗红，和周围组织有粘连；镜下，正常组肾脏肾小体、肾小管及间质未见明显异常。模型组肾球囊部分脏层上皮细胞增生，囊壁增厚，少数肾小球球囊发生粘连；大部分肾小球系膜细胞增生，基质增生，嗜酸性增强，少量血管球毛细血管腔节段性闭塞，可见毛细血管球內微血栓形成，血管球局部呈均质红染。绝大多数小管上皮细胞水肿，部分肾小管萎缩消失，部分小管扩张，少数极度扩张呈囊性。小管中可见较多蛋白和细胞管型。肾脏间质慢性炎细胞浸润，伴纤维组织增生。肾脏包膜增厚，可见均质红染改变。出现慢性肾衰纤维化的病理改变，病变程度较重，肾衰模型建立成功。

模型对照组比较，阳性对照组和NSF组肾小球囊脏层上皮细胞增生例数较少；肾小体血管球系膜增生程度较轻；变性血管球数量稍少，未见血管球毛细血管腔节段性闭塞；间质炎细胞浸润例数及纤维组织增生例数较少。肾小管萎缩、扩张病变无改善。可见阳性对照组和NSF组大鼠5/6肾切除残余肾脏肾小体及间质病变发生率减低。提示NSF对肾脏纤维化有抑制作用，有减轻病变程度的作用。

3.4血清TNF-α、IL-6检测 ELISA方法检测外周血中TNF-α、IL-6的含量，结果显示NSF组、阳性对照组、假手术组TNF-α和IL-6含量均明显低于模型对照组（P<0.05）；三组组间比较无统显著差异（P>0.05）。（表2）

4 讨论

早在2000年，Schoming等科学家就提出尿毒症患者体内存在微炎症状态（microinf lammatory state）。后续研究发现[6]，原发及各种继发肾脏疾病均存在机体免疫功能失常，由于肾脏功能逐渐失代偿，体内代谢产物蓄积可刺激机体各种炎性因子异常表达，最终机体将处于长期炎症反应和氧化应激状态。CFR与微炎症两者客观共存，CFR本身可以导致炎症应答，诱发炎症状态；而微炎症又是CRF的加重因素，通过多因素多途径参与并加重CRF病程的进展及其并发症的发生，加速肾功能的恶化，两者相互促进，形成恶性循环[7]。微炎症状态下，机体发生以单核巨噬细胞系统激活TNF-α、IL-6为主的促炎症细胞释放为中心的炎症反应。国内外研究报道[8] [9]，CRF无论透析或非透析状态，都存在明显微炎症状态，TNF-α、IL-6等关键细胞因子较正常明显增高；早期发现和干预微炎症状态，降低TNF-α、IL-6等细胞因子水平，对慢性肾脏病患者的预后有十分重要的临床意义。

目前对微炎症状态的干预治疗仍缺乏一种有效的方法。相关研究报道表明他汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂、受体拮抗剂、左旋卡尼汀、抗氧化剂等药物的使用，可在不同程度上干预和改善患者的微炎症状态。但微炎症状态的发生发展中，复杂的细胞信号转导和信息分子之间对的交叉对话，导致单一因素或单一作用靶点的药物应用效果并不理想。能通过多靶点、多途径发挥综合疗效的药物成为研究热点。

NSF是中药地耳草有效成分的提取物。地耳草，又名田基黄、赶黄草，具有利湿退黄、清热解毒、活血消肿、散瘀止痛等功效。传统医学中主要应用于肝炎治疗，亦有治疗肝硬化的报道。现代药理学研究，进一步揭示了地耳草的药理作用包括保肝、抗氧化、治疗肝炎、抑菌、抗病毒、调节免疫、抑制肿瘤细胞等。地耳草应用于肾病治疗，虽有临床报道，但未见系统实验研究。

本课题组前期实验发现，NSF对慢性肾衰竭模型大鼠有改善肾脏功能的作用，对模型大鼠肾脏纤维化及纤维化相关细胞因子有干预效果。本实验设计采用5/6肾切除大鼠模型，观察NSF对模型大鼠肾功、肾脏病理形态学变化，确立药物对肾衰模型的治疗作用；并选取CRF时微炎症状态相关的细胞因子指标TNF-α、IL-6进行检测，探索药物对肾衰微炎症状态的干预作用。

实验结果显示肾衰模型成功建立，NSF对该模型大鼠肾脏功能改变及形态学病变均有改善作用；5/6肾切除大鼠模型组血清TNF-α、IL-6表达均增加，与国内外临床及实验报道结果一致；而NSF组血清TNF-α、IL-6表达下降，该结果提示NSF能下调模型大鼠TNF-α和IL-6的表达，改善其微炎症状态，延缓慢性肾衰竭的发展。在后续实验中，可考虑加入NSF对微炎症状态相关并发症效应指标的检测。如NSF对CRF的血脂及血脂相关细胞因子的影响，探索NSF通过改善CRF微炎症状态，发挥其对终末肾病常见并发症动脉粥样硬化的防治作用。为后续进一步发掘中药地耳草对慢性肾衰及其并发症的防治机制，开拓地耳草在疾病治疗中的应用领域打下基础。

参考文献

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[4] 余晓红. 地耳草颗粒治疗慢性肾功能不全23例[J]. 华西医学， 2009， 24（10）： 2711-2711.

[5] 王邦鼎. 地耳草汤治疗急性肾炎62例[J]. 实用中医药杂志， 2004， 20（9）： 493-493.

[6] Krasniak A， Drozdz M， Pasowicz M， et al. Influence of microin-flammation and oxidative stress on atherosclerosis progression and calcifications in cardiovascular system of hemodialyzed patients during two years follow-up [J]. Przegl Lek， 2007， 64（3）：140-147.

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[8] 洪麗萍，周晓玲，陈孟华，等.慢性肾脏病非透析患者微炎症状态分析[J].宁夏医科大学学报，2010，32（3）：348-351.

作者简介：

赵静（1982— ），女（回族），四川成都人，现任成都中医药大学基础医学院讲师， 610075，研究方向：中药免疫安全性与有效性评价。

通讯作者简介：

高永翔（1965— ），男（汉族），四川成都人，现任成都中医药大学基础医学院教授，博士生导师，研究方向：中药免疫安全性与有效性评价。