SIRT1、p53、Ki—67在结直肠癌中的表达及意义

康军朋等

【摘 要】目的：研究SIRT1在结直肠癌中的表达情况，分析它与临床病理学特征及相关基因表达水平的关系，以期探讨结直肠癌发生和发展的机制。方法：应用免疫组化Envision两步法检测60例结直肠癌组织和30例正常结直肠黏膜组织中SIRT1的表达情况，分析SIRT1的临床病理学意义，以及与p53、Ki-67之间的相互关系。结果：60例结直肠癌中，SIRT1在结直肠癌中的阳性表达率高于正常结直肠黏膜（P<0.05）。SIRT1表达与结直肠癌浸润深度（P=0.021）、淋巴结转移（P=0.020）、pTNM分期（P=0.003）、p53的表达（P=0.024）、Ki-67的表达（P=0.021）均呈正相关，SIRT1在有淋巴结转移组中的阳性表达率高于无淋巴结转移组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：SIRT1在结直肠癌组织中呈高表达，且与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期有关，SIRT1的表达与p53、Ki-67的表达呈正相关，提示SIRT1可能参与结直肠癌的发生发展，并可能成为判定结直肠癌恶性程度及评估手术治疗患者预后的生物学指标，联合检测SIRT1、p53和Ki-67的表达对评估结直肠癌患者的病情提供一定的理论依据，并可作为有效的治疗靶点。

【关键词】SIRT1；结直肠肿瘤；p53；Ki-67

【中图分类号】R735.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）04-2069-02

结直肠癌（colorectal cancer， CRC）是最常见的恶性肿瘤之一，在全球恶性肿瘤中的发病率已位居第3位[1]，侵袭和转移仍然是其不良预后的主要原因，其转移的潜在性通常难以预测，尚缺乏有效的早期诊断手段，严重危害人民的健康。沉默信息调节因子1（sirtuin type 1，SIRT1）是目前肿瘤学研究的热点基因之一，是依赖于NAD+的Ⅲ类组蛋白脱乙酰酶，是Sir2的哺乳動物同源物，在体内通过去乙酰化修饰作用，调节基因表达，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞生物学过程。近年研究发现，SIRT1蛋白在多种实体瘤中高表达，它可通过凋亡相关因子p53[2]途径调节多种生理学底物，如HIC1、FOXO、DBC1等的转录、翻译，还可以通过调节基质金属蛋白酶2[3]（Matrix metalloproteinase-2）、C-MYC[4]等、沉默抑癌基因[5]、促进多药耐药基因（MDR1）的表达[6]影响细胞寿命，进而参与肿瘤的发生发展与耐药以及肿瘤细胞的浸润转移。本研究应用免疫组化染色方法，检测SIRT1在结直肠癌及癌旁正常组织中的表达，分析其与临床病理参数的关系，探讨SIRT1在结直肠癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象：收集2007年3月至2012年4月在保定市第一中心医院行手术切除的结直肠癌存档蜡块60例为实验组及结直肠镜活检证实为正常的结直肠黏膜30例为对照组，所有CRC患者诊断明确，术前均未行任何放化疗及内分泌治疗，均经外科手术切除后送检病理检查，证实为原发性CRC，且为首发，均未合并心脏病、脑血管疾病及其他系统疾病，病理资料完整。两组病例的性别、年龄之间比较差异均无统计学意义。实验组男性33例，女性27例；结肠35例，直肠25例；年龄23-77岁，平均年龄54.7±11.6岁；所有病例资料完整，包括血清CEA值。全部标本术后立即取材，经10%中性福尔马林液固定，常规处理后石蜡包埋。

1.2 免疫组化：采用Envision两步法。将石蜡切片中仍能见到癌组织的石蜡切片做SIRT1指标的免疫组织化学检测，通过对病例资料进行查漏登记，发现有些病例免疫组化结果中无p53、Ki-67，将相应病例的组织蜡块挑出，与SIRT1同时行免疫组化检测。所用试剂：兔抗人SIRT1单克隆抗体（克隆号[E104]ab32441）购于美国Abcam公司，工作浓度均为1：100；p53、Ki-67为即用型单克隆抗体，二抗为快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物，均购自福州迈新公司，免疫组化检测试剂盒、浓缩型DAB试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司。参照试剂盒说明操作，以PBS代替一抗做阴性对照，已知阳性切片做阳性对照，光镜下观察染色结果，所有切片染色结果均由两名资深病理医师复审，以提高结果的可靠性。

1.3 结果判定：SIRT1蛋白主要定位于细胞核中，P53蛋白定位于细胞核，无背景着色情况下以胞核出现黄色或棕色颗粒者为阳性染色；每例均随机观察10个高倍视野，用半定量积分法判断结果：①黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；②计数10个高倍视野，阳性细胞在同类细胞中所占百分率<25%为0分，26%-50%为1分，51%-75%为2分，>75%为3分；③按上述两项指标的分数乘积高低分为：0分为阴性（-），1-3分为弱阳性（+），4-6分为中度阳性（++），7-9分为强阳性（+++）。Ki-67结果判定标准：记数阳性肿瘤细胞数所占的比例，以5%为单位进行半定量评估，≤5%定义为阴性表达，>5%定义为阳性表达。

1.4 统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件，计数资料采用χ2检验，相关性采用Spearman等级相关分析，以α=0.05作为检验标准，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SIRT1在CRC和正常结直肠黏膜组织中的表达

SIRT1阳性着色定位于细胞核，呈黄色或棕黄色颗粒者为阳性着色（图1），94例结直肠癌中SIRT1阳性表达率为81.7%（49/60），30例正常结直肠粘膜中SIRT1阳性表达率分别为36.7%（11/30），两组比较差异有统计学意义（χ2=18.225，P=0.000）。

图1a SIRT1在正常结直肠黏膜组中呈阴性表达 SP法

图1b SIRT1在结直肠癌组织中呈阳性表达 SP法

2.2 SIRT1表达与CRC临床病理特征的关系

CRC中SIRT1的表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织学分化、远处转移及癌胚抗原（CEA）等无关，差异均无统计学意义（P>0.05）；SIRT1的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及临床分期呈显著正相关，晚期、浸润较深、有淋巴结转移的阳性率高于早期、浸润较浅、无淋巴结转移的阳性率，差异有统计学意义（P<0.05，表1）。

2.3 CRC中SIRT1、p53、Ki-67的表达及相关关系

SIRT1阳性表达49例中，p53阳性表达率为69.4%（34/49），SIRT1阴性表达11例中，p53阳性表达率为27.3%（3/11），二者差异有统计学意义（χ2=5.761，P=0.016）；SIRT1阳性表达病例49中，Ki-67阳性表达率为83.6%（41/49），SIRT1阴性表达病例11例中，Ki-67阳性表达45.5%（5/11），二者差异有统计学意义（χ2=5.354，P=0.021，表2），SIRT1表达与p53、Ki-67表达呈正相关。

3 讨论

SIRT1广泛表达于胎儿及成人组织中，作为sirtuin家族中研究最为广泛的成员之一，已被证实与多种生理学事件相关，其生理功能均涉及DNA损伤修复、基因转录沉默、细胞生长周期调控、能量代谢、血管生成、神经保护等，通过限制能量摄入过程激活SIRT1，可延长细胞寿命，故有“长寿基因”之称[7]。目前SIRT1在肿瘤细胞中的作用尚未得到统一，现有累积的证据支持SIRT1在肿瘤的形成中具有双重作用，一方面由于SIRT1具有抗炎、基因组稳定性和促进癌细胞死亡的作用，SIRT1基因缺失将导致遗传不稳定性及致癌作用，另一方面，SIRT1可通过刺激肿瘤信号传导通路，创建肿瘤微环境利于癌细胞的生长和存活，且具有钝化抑癌基因和DNA损伤修复蛋白的作用，被认为是肿瘤促进因子。相关研究证实SIRT1在不同组织中有不同的致瘤作用，在皮肤癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌中高表达，而在膀胱癌中表达降低，SIRT1在肿瘤中的这种双重作用可能与亚细胞定位状态密切相关[8]，核浆中具有不同的特异性底物，且由于其调节底物众多，近年来备受关注。本实验研究发现SIRT1阳性表达定位于细胞核，未发现细胞质中有阳性表达，SIRT1在CRC组织中较正常组织中表达增高，且SIRT1的表达与CRC的肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期呈正相关，SIRT1在有淋巴结转移组中的阳性表达率高于无淋巴结转移组，差异具有统计学意义，说明SIRT1的高表达可能与肿瘤的侵袭、预后有关，SIRT1可能通过某种机制促进肿瘤淋巴结转移，并可能成为判断结直肠癌恶性程度及预后的指标。研究发现[9]SIRT1通过去乙酰化核因子NF-κB的RelA/P65亚基降低其转录活性而负性调节基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase-9，MMP9）而影响癌细胞的浸润和转移。Lovaas等[3]研究证实SIRT1在晚期前列腺癌组织中高表达，并通过去乙酰化基质金属蛋白酶2（Matrix metalloproteinase-2，MMP2）的表达来促进前列腺肿瘤细胞的侵袭。

p53是最早发现的SIRT1的生理底物[2]，SIRT1可去乙酰化及钝化p53蛋白而发挥抗凋亡效应。p53在体内有野生型和突变型两种，野生型p53具有抑癌作用，突变型p53由于丧失其抑癌功能使细胞无限增殖而诱发肿瘤，由于野生型p53半衰期短，利用免疫组化方法只能检测到突变型p53的表达。研究显示[10]SIRT1 和 p53 之间的关系较为复杂，在野生型p53表达的细胞中SIRT1过表达具有致癌作用，在突变型p53表达的细胞作用却相反。在本研究中发现，SIRT1表达与p53表达呈显著正相关，提示这两个因子在结直肠癌的发展进程中可能起到了正调节协同作用，肿瘤中SIRT1的表达和p53突变有关，但是这种关系尚需进一步研究证实，因为p53突变可能会改变SIRT1对p53活性的生物学影响。SIRT1介导的p53去乙酰化在转录和翻译过程中存在多个反馈条路，包括与抑癌基因HIC1、DBC1形成的HIC1-SIRT1-p53通路、DBC1-SIRT1-p53通路，还可与miRNA-34a、Myc以及Necdin形成反馈条路，影响肿瘤的发生发展。SIRT1的抑制剂尼克酰胺[11]可以抑制慢性淋巴细胞白血病中高表达的SIRT1的活性，如果淋巴细胞表达野生型p53，那么尼克酰胺可以抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡。由于SIRT1通过p53途径调节的底物因子众多，其机制相当复杂，p53与SIRT1之间的关系还需搜集更多的临床数据进行深入研究。

Ki-67基因定位于10号染色体，是一种DNA结合蛋白，表达于除G0外的整个细胞周期中，是反映组织细胞增殖活性的重要指标，其阳性着色的细胞百分比可用来客观评价细胞的增殖状态。研究表明，细胞增殖标志物Ki-67的表达与乳腺癌的临床病理特征及预后相关联，并且在评估新辅助化疗及内分泌治疗的疗效方面具有重要的预测价值。Ki-67高表达可作为乳腺癌的不良预后因素，其与肿瘤的发展、转移和预后高度相关。本实验中结直肠癌组织中Ki-67在SIRT1阳性组的表达水平明显高于SIRT1阴性组，这与Feng等[12]研究结果一致，提示SIRT1阳性病例中更多的肿瘤细胞处于增殖活跃状态，SIRT1阳性表达的肿瘤患者预后教阴性表达者差。

综上所述，SIRT1可能参与了CRC的发生、发展，联合检测SIRT1、p53、Ki-67比單独检测SIRT1的表达可能具有更重要的临床意义，可作为评估CRC恶性程度及临床预后的生物学标记物。CRC的治疗目前以手术治疗为主，辅以化疗治疗，而耐药的形成往往使肿瘤细胞免受化疗药物而影响化疗疗效及预后。Chu等[13]研究证明，SIRT1参与肿瘤细胞的放化疗耐受，与肿瘤耐药性关系密切，用SIRT1去乙酰化酶抑制剂克服肿瘤细胞的多药耐药性，有可能具有应用前景。Chen[14]等研究表明抑制SIRT1不仅帮助消除慢性髓细胞白血病干细胞，也能阻止耐药性的产生，对治疗其他恶性肿瘤也有益，这无疑对术后辅助化疗及晚期失去手术机会依赖化疗的患者提供了临床指导意义。SIRT1作为一种新的治疗靶点，值得进一步研究。

参考文献

[1] 吕强，邢沈阳，赵志辉等，结直肠癌的研究现状及展望，中国实验诊断学，2009，13（8）：1134-7.

[2] Yi J，Luo J.SIRT1 and p53，effect on cancer，senescence and beyond[J]. Biochim Biophys Acta，2010，1804（8）：1684-89.PMID：20471503

[3] Lovaas JD，Zhu L，Chiao CY，et al.SIRT1 enchances matrix metalloproteinse-2 expression and tumor cell invasion in prostate cancer cells[J].Prostate，2012， Oct 4. doi： 10.1002/pros.22592. PMID： 23038275

[4] Mao B， Zhao G，Lv X，et al.Sirt1 deacetylates C-MYC and promotes C-MYC/Max association[J].Int J Biochem Cell Biol，2011，43（11），1573-1581.PMID：21807113

[5] Pruitt K，Zinn Rl，Ohm JE，et al.Inhibition of SIRT1 reactivates silenced cancer genes without loss of promoter DNA hypermethylation[J].PLOS Genet，2006，2（3）：e40.PMID：16596166

[6] Chu F， Chou PM， Zheng X， et al.Control of multidrug resistance gene mdr1 and cancer resistance to chemotherapy by the longevity gene sirt1[J].Cancer Res，2005，65（22）：10183-10187.PMID：16288004

[7] Li Y，Tollefsbol TO.P16（INK4a）suppression by glucose restriction contributes to human celluar lifespan extension through SIRT1-mediated epigenetic and genetic mechanism[J].PLos One，2011，6（2）e17421.PMID：21390332

[8] Song NY， Surh YJ. Janus-faced role of SIRT1 in tumorigenesis[J]. Ann N Y Acad Sci，2012，1271：10-9.PMID： 23050959

[9] Nakamaru Y， Vuppusetty C， Wada H，et al. A protein deacetylase SIRT1 is a negative regulator of metalloproteinase-9[J].FASEB J. 2009，23（9）：2810-9. PMID： 19376817

[10] Brooks C L， Gu W. How does SIRT1 affect metabolism， senescence and cancer[J]？ Nat Rev Cancer，2009，9（2）：123–128.PMID：19132007.

[11] Audrito V， Vaisitti T， Rossi D， et al.Nicotinamide blocks proliferation and induces apoptosis of chronic lymphocytic leukemia cells through activation of the p53/miR-34a/SIRT1 tumor suppressor network [J].Cancer Res，2011，71（13）：4473-83. PMID： 21565980

[12] Feng AN， Zhang LH， Fan XS， et al. Expression of SIRT1 in gastric cardiac cancer and its clinicopathologic significance[J]. Int J Surg，Pathol，2011，19（6）：743-50. PMID： 21865267

[13] Chu F， Chou PM， Zheng X， et al.Control of multidrug resistance gene mdr1 and cancer resistance to chemotherapy by the longevity gene sirt1 [J].Cancer Res，2005，65（22）：10183-10187. PMID： 16288004

[14] Chen W. Accelerating cancer evolution： a dark side of SIRT1 in genome maintenance[J]. Oncotarget，2012，3（4）：363-4. PMID： 22622047

通訊作者简介：

郭淑芹，女，河北保定人，教授，硕士生导师，研究方向：内分泌肿瘤医学。