微孢子虫糖蛋白的研究进展

吴海晶 耿莉娜 周泽扬

摘要 随着蛋白质组学和糖组学研究的迅速发展，糖蛋白已成为众多研究的中心。糖蛋白的糖链结构直接影响其功能，因此糖蛋白中糖链的结构研究成为糖生物学研究的重点之一。就糖蛋白研究的基本策略方法作了简要介绍，并且简要概括了近年来微孢子虫糖蛋白的研究进展。

关键词 糖蛋白;糖链;分离鉴定;结构分析;质谱;核磁共振

中图分类号 S182  文献标识码

A  文章编号 0517-6611（2014）34-12017-03

Research Progress of Glycoprotein in Microsporidia

WU Haijing1， GENG Lina2， ZHOU Zeyang3*  （1. Chongqing University of Technology， Chongqing 400054; 2. Chongqing Tobacco Science Research Institute， Chongqing 400715; 3. The State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology， Southwest University， Chongqing 400715）

Abstract  With the rapid development of proteomics and glycomics research， glycoprotein has become the center of many studies. And the complex function of glycoprotein attribute to its diverse structure which was one of the important content of glycobiology. The recent research on global methods for protein glycosylation analysis were introduced. Finally this review covers aspects of the progress of glycoprotein in microsporidia.

Key words  Glycoprotein; Sugar chain; Isolation and identification; Structure analysis; Mass spectrometry; NMR spectroscopy

基金項目 国家自然科学基金（NO.30930067，31270138，31101770）。

作者简介

吴海晶（1986- ），女，河北邯郸人，助教，硕士，从事微生物基因组与次生代谢方面的研究。*通讯作者，教授，博士，博士生导师，从事家蚕分子生物学、家蚕病原生物学方面的研究。

收稿日期 20141027

蛋白质糖基化修饰是真核生物蛋白质最常见的翻译后修饰。研究发现，有近一半以上的蛋白质都有可能存在着糖基化的修饰。正在合成的蛋白质或合成后的蛋白质在糖基转移酶作用下，可以将活化的单糖或多糖加到该肽链上[1]。糖链的形成往往改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质的功能。蛋白质的糖基化作用对该蛋白质的功能产生重要的影响，例如在蛋白质的构象稳定、折叠、运输及定位等方面起着重要作用;多数蛋白质表面的糖链都能够诱发特定的免疫反应，且与免疫相关的关键分子几乎都是糖蛋白;大多数微生物依靠糖链为介导，进而黏附到宿主细胞表面，如许多革兰氏阴性菌的黏附就是由细菌黏附素、宿主糖链相互作用介导的，并由此决定病原微生物的宿主范围和组织趋向;糖蛋白还参与受体激活，信号转导，细胞分化、增殖、凋亡及衰老，精卵识别等众多重要的生物进程[2]。自20世纪末提出“糖组学”（Glycomics） 概念以来，人们就将研究对象锁定为糖蛋白，主要研究蛋白质糖基化的基因信息、糖基化的位点信息、糖基化的结构信息及功能信息。而糖链结构的复杂性极大地制约了糖蛋白的研究速度。

1 糖蛋白的类型

糖蛋白是由长度较短、带分支的寡糖同多肽链经过共价连接形成的蛋白。通常，糖蛋白中的糖链可分为直链和分支链，糖基数一般有1～15个不等，当然也有20个糖基的巨寡糖存在。不同的糖蛋白分子糖链的数目是不相同的，而且分布也很不均匀。糖蛋白中的糖链可根据糖肽键的类型分为N连接的糖链、O连接的糖链两大类，分别简称为N糖链和O糖链。这两类糖链可单独或同时出现在同一糖蛋白中。它们在结构上各自有自己的特点。

1.1 N连接的糖链

N连接糖蛋白是由寡糖中的N乙酰葡萄糖与多肽链中天冬酰胺残基的酰胺氮连接而形成的。通常，含有潜在的糖基化位点AsnXSer/Thr（X是脯氨酸以外的任何氨基酸） 3 个氨基酸残基组成的一个序列段;N糖链由五糖核心结构（N连接的糖蛋白链均含此结构）连接其他糖的情况，通常可分为3 类：高甘露糖型，是由N乙酰葡糖胺（GlcNAc） 和甘露糖组成，在五糖核心上再连接上2～9个甘露糖，如卵蛋白;复杂型，除N乙酰葡糖胺（GlcNAc）和甘露糖外，还有半乳糖、果糖、唾液酸与五糖核心相连;杂合型（混合型）是既有高甘露糖链又有N乙酰氨基半乳糖链共同连接在五糖核心结构上。

1.2 O连接的糖链

O连接糖蛋白是由寡糖中N 乙酰半乳糖与多肽链的丝氨酸或苏氨酸残基的羟基相连而形成的。O糖链的结构比N糖链的结构相对简单一些，但是O连接的糖链也存在多种连接形式。这些结构具有一个共同点，即由一个或少数几种单糖与某些含羟氨基酸相连接，大体分为岩藻糖Fuc 和Ser/Thr的OH 连接、N乙酰葡糖胺（GlcNAc）和Ser/Thr 的OH连接、 N乙酰半乳糖胺（GalNAc） 和Ser/Thr 的OH连接。不存在共有的核心结构，但在GalNAcSer（Thr）形式糖链中至少已发现6种核心结构。

2 糖蛋白的研究方法

蛋白质的糖基化修饰分析是糖蛋白研究的重要部分，目前国内外许多学者已开展了糖蛋白质组学的研究。据文献报道，现在研究糖蛋白的技术一般是使用凝集素亲和层析的方法分离得到糖蛋白，经电泳染色分析糖蛋白，释放糖链，最后使用质谱等方法分析其结构。

2.1 糖蛋白/糖肽分离纯化

常用凝集素亲和层析法来进行糖蛋白和糖肽的分离纯化。 不同来源的植物凝集素对不同结构的糖链具有特异的亲和性。许多凝集素已被分离出來，并应用于商品化，如菜豆凝集素（Phaseolus vulgaris agglutinin，PHA） 能够与N乙酰半乳糖胺进行结合;麦芽凝集素（Wheat germ agglutinin，WGA）可以同 N乙酰葡糖胺、N乙酰半乳糖胺和N乙酰神经氨酸进行结合;刀豆蛋白A（Concanavalin A，Con A） 可以特异性地结合D甘露糖、D半乳糖和N乙酰葡糖胺单糖，识别N聚糖糖蛋白，在结合糖蛋白的同时结合单糖和糖脂;大豆凝集素（Soybean agglutinin，SBA）特异性结合D半乳糖和N乙酰半乳糖胺[3]。这几种凝集素可以配合使用。2008年Cosima等[4]研究血清中糖蛋白的性质，先使用刀豆蛋白A（Con A）、麦芽凝集素（WGA）和黑接木骨凝集素（SNA）3种凝集素分别进行亲和层析，然后组合进行亲和层析，得到糖蛋白，成功地鉴定得到45种蛋白质中86个N糖基化位点。糖蛋白也可以经凝胶电泳后染色来鉴定。常用的染色方法有PAS（过碘酸Schiff）法、银染法、荧光染色法，也可以使用凝集素印迹（lectin blot）特异地对不同糖蛋白进行显色识别[5]。

2.2 糖链的释放

糖链的释放一般存在化学释放和酶释放2种方法。我们分别称之为化学法和酶法。

N连接聚糖常使用肽N糖苷酶F（PNGase F）对其进行水解。它是一种酰氨酶，能在N糖蛋白的高甘露糖、杂合或复合寡糖部分的最内侧N乙酰半乳糖胺（GalNAc）和天冬酰氨残基之间进行切割。与此同时，令天冬酰胺转变为天冬氨酸，进而造成其相对分子质量增加0.98，起到质量标记N糖基化位点的作用。而对O连接聚糖目前只有一种酶，内切αN乙酰半乳糖胺酶即 O糖苷酶，断裂N乙酰半乳糖胺（GalNAc） 和Ser/Thr 连接。化学法有肼解法和β消除法。肼解法用于释放含N乙酰氨基葡萄胺（GlcNAc）和Asn连接的糖蛋白。β消除反应被广泛应用于含N乙酰半乳糖胺和丝氨酸或苏氨酸（GalNAcSer/Thr）连接的糖蛋白。

2.3 糖链的结构分析

质谱（MS）技术和核磁共振（NMR）技术是糖链结构解析方面应用最广泛的2种技术。这2种技术各有其利弊，在实际的使用中经常互补。近几年来，对糖蛋白中糖链部分的分析方法有相关报道，但是没有一些突破性的进展。在当前研究环境下，不具备规模化直接分析糖链组成、结构的相关技术条件。这也成为糖蛋白的研究长期以来滞后于核酸、蛋白研究的一个主要原因。

2.3.1 生物质谱法。

质谱是目前应用比较广泛的一项技术。它可以对糖链进行结构分析，进而解析糖链的结构[6]。电喷雾质谱（ESIMS） 和基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDITOFMS） 具有独特的“软电离”方式，能够很好地对难挥发、高极性、热不稳定的糖等生物大分子进行结构分析，进而被称为生物质谱。在糖链结构的研究中，ESIMS无需衍生化就可以确定出糖链的组成结构，但是易受到样品和溶剂中干扰物的影响;MALDITOFMS 因其对干扰物忍受力强、产生的碎片离子少以及图谱没有ESIMS 中的多电荷特性而更易解析等优点而成为目前研究糖链结构解析的常用工具[6]。

随着质谱技术的不断发展以及多级串联质谱技术的应用，对糖蛋白的研究尤其是对寡糖链结构的研究更加准确、简便。一般，ESIMS 和MALDIMS可借助碰撞诱导解吸（CID）、源后衰变（PSD）等相关技术尽可能获得详尽的糖链结构信息[7]。2008年Cosima等[4]使用MALDITOF MS 和LCESIMS/MS质谱分析了由凝集素亲和层析和亲水色谱柱富集到的血清中糖蛋白，结合2种方法，共得到38种蛋白中的63个糖基化位点，证明2种方法存在的差异可以互为补充。另外，傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（FTICR） 也具有高灵敏度和分辨率，其质量精确度高达1×10-6，可与2DE 一起使用来分析糖蛋白。2004年Froesch等[8]结合全自动芯片电喷雾和傅里叶转换离子回旋共振（FTICR）质谱这两项技术，用于糖组学的研究。2006年Vakhrushev等[9]利用傅里叶转换离子回旋共振（FTICR）质谱分析尿液，诊断先天性糖蛋白糖基化缺陷（Congenital disorders of glycosylation，CDG）和其他疾病。

MS的灵敏度非常高，能够精确地测定质量，在某种情况下可以得到糖链序列相关的信息。但是，与普通蛋白不同的是，糖蛋白的分子结构通常是不均一的，包括糖链的微不均一以及糖基化位点的不均一。这些不均一性给糖蛋白的质谱测定带来很大困难，严重影响质谱分析的灵敏度，而且MS不能区分参与糖链构造中各种单糖的同分异构体，也不能提供出糖链的连接位置、差向异构等结构方面的相关信息。

2.3.2 核磁共振法（NMR）。

目前，NMR 技术是糖链立体化学结构分析中一种最重要的技术方法，可以确定出糖链的构型、连接位置、分支和微观多样性。

早在1983年Vliegenthart等[10]就利用高分辨率的1HNMR技术对与天冬酰胺连接的糖肽进行研究。由于NMR 测定讯号峰重叠严重，解析较难，灵敏度不高，且对样品纯度要求极高，多维NMR 需要样品为毫克级，对大多数糖复合物中的微量糖链来讲是很难达到的，因此在蛋白质糖基化分析中的应用并不广泛。但是，NMR在糖链结构的检测特别是糖链的连接方式以及分支结构分析的优点，促进NMR在糖基化分析中的发展[11]。Shaw 等[12]使用二维1HNMR技术对维持花生过氧化物酶稳定的3个糖链进行了结构分析。Yamaguchi等[13]使用核磁共振二维核欧沃豪斯增益谱（13C13C NOESY）、核磁共振总相关谱（13C13C TOCSY）和1HNMR技术相结合来进行较大糖蛋白的糖链分析。目前已经出现了纳米NMR用于组织细胞复杂糖链的分析[14]。

最近有科学家将微阵列技术（Microarray） 引入糖蛋白组学研究，可广泛用于糖蛋白的糖链分析，以对生物个体产生的全部蛋白聚糖结构进行系统鉴定与表征[15]。Pilobello 等[16]将凝集素固定在芯片上，建立了凝集素微阵列技术，以快速分析糖基化蛋白质。虽然目前糖芯片技术尚未成熟，不能够大规模地应用到生物学研究中，但是随着糖基数据库的完善同质谱技术的发展结合使用，必将逐步成为能够广泛应用的生物芯片技术。

3 微孢子虫糖蛋白研究进展

微孢子虫的孢壁作为最先与宿主细胞接触的部分在孢子侵染宿主过程中扮演着重要角色。而孢壁蛋白对微孢子虫的侵染有着直接的关系，但其作用机理还不明确，微孢子虫孢子壁、极帽、极膜层以及极管上存在一些糖蛋白、糖结合物。2005年，Hayman等[17]发现

肠道微孢子虫（E.intestinalis）利用宿主细胞表面的硫酸化的GAGs（糖胺聚糖）特异性地黏附到宿主细胞表面，而且微孢子虫利用这种机制增加了对宿主细胞的感染，并且发现添加外源性的硫酸聚糖可以降低孢子的感染率。2007年Southern等[18]得到了肠道微孢子虫孢壁蛋白 EiEnP1，可以使孢子黏附并感染宿主细胞。EnP1含有3个肝素结合基序。该基序可能识别并结合宿主细胞表面的葡聚糖，从而介导孢子黏附和宿主细胞感染，进一步证实在孢子与宿主细胞的黏附过程中主要是利用宿主细胞表面的糖胺聚糖（GAGs）起作用。

在微孢子虫研究中关于糖蛋白的研究还很少。目前微孢子虫糖蛋白的生化信息主要来自于凝集素结合试验。2001年Hayman等[19]得到肠道微孢子虫（Encephalitozoon intestinalis）的2个外孢壁蛋白（SWP1，SWP2）。根据感染细胞的裂解物与ConA（伴刀豆蛋白）或WGA（麦芽凝集素）-包被的磁珠结合后与特异性的抗体反应检测结果，推测含有N糖基化。2003年Xu等[20]通过Con A亲和层析的方法得到PTP1， 2004年分析了PTP1的糖基化位点，发现PTP1的O甘露糖化影响脑炎微孢子虫（E.hellem）对宿主细胞的感染，加入外源性的甘露糖可以降低孢子的感染率。极丝蛋白1（PTP1）被认为含有O甘露糖基化（Omannosylated），只是因为其与O乙酰葡糖氨（OGlcNAc）的抗体不发生反应，而在10种凝集素中只与ConA结合，并且这种结合可以被NaOH处理去除。这种O甘露糖基化作用（Omannosylation）与相近的物种兔脑炎微孢子虫（E.cuniculi）的基因组序列分析结果一致[21]。随后，2006年Xu等[22]通过蛋白质组学技术，成功鉴定了20 kDa的SWP3。它定位在孢子内壁上。SWP3可能含有糖基磷脂酰肌醇锚定位点 （GPI anchor），通过免疫电镜技术发现在孢子繁殖（Sporogony）时处于细胞表面，在成熟孢子中是定位在孢子内壁上，还含有一些O糖基化位点，很可能是一种糖基化蛋白。2007年Taupin等[23]利用电子显微镜技术、质谱技术和核磁共振技术研究兔脑炎微孢子虫和蝗虫微孢子虫（A.locustae）的甘露糖基结合物（Mannoconjugates）的定位、结构，在电子显微镜水平用甘露糖特异性结合的凝集素标记试验表明极帽和极膜层是富含甘露糖的糖蛋白的主要区域，利用质谱及核磁共振技术分析葡聚糖片段确定了联接在微孢子虫蛋白质上的寡糖结构为O糖苷键连接的线性的甘露糖基化的低聚糖，并且兔脑炎微孢子虫和蝗虫微孢子虫不存在N糖苷或存在的量很少而达不到可检测的水平。在家蚕微孢子虫中，2008年吴正理[24]通过质谱方法得到14种孢壁蛋白，对其序列进行糖基化位点在线预测（http：//www.cbs.dtu.dk/services/），得到其中有10个假定的孢壁蛋白存在N糖基化位点而无O糖基化位点。这一预测结果是否正确，还需要进一步的研究。

4 展望

糖蛋白结构复杂，主要是由于糖链的结构复杂，不单表现糖链序列的多样，还在于其合成没有模板，而是经过酶促反应在细胞内质网和高尔基体中生成的。近些来，随着蛋白质组学技术的发展，糖蛋白质组学的研究也得到很大的进步。从现阶段来看，对于糖蛋白质组的研究还主要集中在方法学的开发和利用方面。对糖基化位点的研究方法也不断得到改进，但主要问题的解决还要依赖于质谱的进一步發展。该实验室对家蚕微孢子虫孢壁蛋白中糖蛋白的研究才刚刚开始。根据家蚕微孢子虫孢壁蛋白的预测信息来验证孢壁蛋白中糖蛋白的类型，寻找其可能发挥的作用，以期能揭示其侵染宿主的的奥秘。

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