阶梯缓释抗结核纳米人工骨复合体成骨性能的实验研究*

席焱海赵鹏 邓翠君 李坤 叶晓健* 何海龙*

论著·实验研究

阶梯缓释抗结核纳米人工骨复合体成骨性能的实验研究*

席焱海1赵鹏2邓翠君2李坤1叶晓健1* 何海龙1*

目的利用静电纺丝等技术制备新型搭载异烟肼、利福平、链霉素三联抗结核药物阶梯缓释纳米人工骨 ( -TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA)，通过修复兔股骨远端骨缺损模型，观察其成骨性能。方法通过建立兔股骨远端骨缺损模型，将缺损区植入的阶梯缓释抗结核纳米人工骨 (-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA)设为实验组 (A组)，缺损区植入 -TCP设为对照组(B组)，缺损区不做处理作为空白组 (C组)。分别在术后4、8、12周进行标本取材，对标本进行大体观察、X线、CT扫描、固定后组织染色分析，进而确定阶梯缓释纳米人工骨的体内成骨性能。结果大体及组织学观察和X线显示 -TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA实验组空白组相比较有着良好的成骨效能。同-TCP组比较成骨效能无明显差别。Lane-sandhu组织学和X线评分均显示：A、B组与C组差异有统计学意义（P＜0.05），A组和B组间差异无统计学意义 (P＞0.05)。结论复合材料 -TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA具有很好的骨传导性和骨再生能力，复合INH、RFP、SM三联抗结核药物后不影响复合材料的体内成骨能力。

骨结核；纳米材料；缓释；静电纺丝；骨缺损

骨结核病在治疗上更多需要外科手术干预。手术切除病灶并进行植骨的同时，全身使用抗结核药物治疗。然而全身用药方式实际到达局部病灶的浓度很低，甚至在血供不丰富的局部组织抗结核药物根本无法到达。病灶清除后使用搭载缓释型抗结核药物人工骨材料进行植骨来加强抗局部抗结核治疗是一种有效的治疗方式。考虑到结核药物治疗需要遵循长程、联合、足量等原则，我们设计出一种新型搭载利福平(RFP)、异烟肼 (INH)、硫酸链霉素三药抗结核药物的阶梯缓释型人工骨材料。通过静电纺丝技术以高分子聚合物聚己内酯 (PCL)为载体，制得负载RFP、INH两药的电纺纳米纤维薄膜，用压片机将其与磷酸三钙(-TCP)、PCL等赋形剂混合压制得到人工骨，将硫酸链霉素 (SM)和海藻酸钠(SA)与得到的人工骨通过交联固化方式最终制备成阶梯缓释抗结核纳米人工骨 (-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA)。本实验通过建立兔股骨远端骨缺损模型，使用该人工骨进行骨缺损修复实验，观察其体内成骨性能，并研究载多联抗结核药物在局部的缓释过程是否会人工骨的成骨产生影响。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料 -TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA制备：精密称定分子量为 8万的 PCL 0.24g，RFP粉末 0.012g/INH粉末0.012g，加入氯仿，得到的溶液在30℃，电压为15kv，流量为0.5ml/h，接收距离为21cm的条件下纺丝4小时，分别得到含 INH和 RFP的药膜。精密称定特制粉末 (-TCP∶PCL∶NaCl(1∶8∶1))0.1g放置于模具中，与INH药膜、RFP药膜交替加载。使用粉末压片机在14KPa压力下，压制2分钟，取出，放置去离子水中浸泡72小时，除去NaCl，取出，晾干，得到 -TCP/INH-RFP-PCL。精确称取质量百分比浓度为1mg/ml的SA 10g，SM 5g，NaCl10g，SA和SM加8.5ml去离子水搅拌溶解，NaCl用10ml去离子水溶解，将含有INH和RFP的去盐人工骨置于SA溶液中超声浸泡5分钟，接着置于NaCl溶液中交联固化10分钟，该混合物取出晾干，即可制得抗结核药物微球复合体 -TCP/INH-RFPPCL/SM-SA。

实验动物选用新西兰大白兔30只(6月龄，雌雄不拘)，体重2.5 kg左右，(第二军医大学动物实验中心提供)。随机分为3组，分别为 -TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA实验组 (A组)、 -TCP对照组 (B组)、空白组 (C组)，每组各9只。

1.2 方法

1.2.1 兔骨缺损模型建立

实验用兔置于固定架中，使用 3%戊巴比妥钠 (30mg/ Kg)经耳源静脉注射麻醉。待兔完全麻醉，仰卧位固定于手术台 (图2-2)。单侧下肢股骨中下段手术区域备皮，酒精和碘伏消毒后铺巾。以股骨远端内髁为中心做纵行切口，长约3cm。依次切开皮肤、皮下组织，从肌间隙进入至股骨内髁，剥离骨膜。于股骨远端1cm股骨内髁处为中心，用电钻开槽并逐渐扩孔至直径6mm，深1cm圆柱形骨缺损，生理盐水冲洗创口，将预备好A、B组材料植入骨缺损处，C组不做处理。依次缝合筋膜、皮肤。术毕给予青霉素20万单位/ kg肌注。

1.2.2 术后随访

术后分笼常规食、水饲养，术后3日予青霉素20万单位/kg肌注，观测生命体征。

1.3 观察指标

1.3.1 术后处理

术后4、8、12周对实验动物行耳源静脉空气栓塞法处死，取后肢股骨标本，浸泡至10%福尔马林溶液中。大体观察3组骨缺损部位修复情况和成骨情况，观察实验组和对照组骨替代组织材料降解吸收情况和骨缺损界面融合情况。

1.3.2 影像学观察

将上述标本组织进行X线和微型CT系统检查。分别由三位有经验的骨科医生独立读片，记录骨缺损的修复情况。依据lane-sandhu评分标准(骨形成情况：①无骨形成-0，骨形成占缺损25%-1，骨形成占缺损50%-2，骨形成占缺损75%-3，骨形成充满缺损区-4；②与骨连接情况：骨折线清晰-0，骨折线部分存在-1，骨折线消失-2；③骨塑型情况：未见塑型-0，髓腔形成-2，皮质骨塑型-4)[1]。收集术后 8、12周各组骨修复情况评分，进行统计学分析。

1.3.3 组织学观察

采用硬组织包埋、切片技术：将切片进行 Van Gieson-苦味酸品红液染色。显微镜下观察材料及周围织的变化以及新骨再生情况。对术后12周各组骨修复情况进行lane-sandhu组织学评价：骨连接情况：无连接：0分；纤维连接：1分；骨与类骨连接：2分；骨连接：3分；骨干完全再生：4分。松质骨：无骨细胞活性：0分；新骨早期聚焦：1分；有活性的新骨聚焦：2分；松质骨正在改造：3分；松质骨完全形成：4分。皮质骨：无皮质骨生长：0分；皮质骨生长的早起表现：1分；皮质骨正在形成：2分；大部分被改造：3分；完全骨再生：4分[1]。

2 结果

2.1 大体标本观察

各组实验用兔术后存活良好，无伤口感染、骨折、排异反应等并发症。

图1 术后12周，A、B组可见骨缺损处基本修复，骨皮质连续，中心部有少部分材料残留未降解。C组缺损处未修复，缺损中心为纤维组织充填，质软

取出骨缺损修复标本后大体可见：在整个骨缺损修复过程中，实验组和材料对照组修复情况类似，术后4周开始，可见材料填充区表面凹陷，材料与骨之间边界模糊，空白对照组缺损边缘有少量成骨，中央为纤维组织充填；术后8周时，两材料组部分降解，填充区表面均能看到明显新骨形成，骨质硬度中，空白对照组骨缺损区表面凹陷，创面内以纤维组织为主，质松软；术后12周，两材料大部分降解，填充区基本平整，有骨皮质形成，质硬，基本愈合，空白对照组与8周时无差异不大 (图1)。

2.2 影像学结果

2.2.1 X线结果

各组 X线结果显示：术后4周两组材料组可见缺损修复区逐渐出现骨膜反应；8周时骨痂形成，部分新骨形成，缺损边缘骨质与材料逐渐融合；12周时可见骨缺损基本被骨组织所替代，骨与材料接触的边界基本消失，成骨可靠。空白对照组至12周仍见明显骨缺损区，无明显骨修复 (图2)。lane-sandhu评分：术后8周：A组 (4.67±0.47)、B组(5.33±0.47)、C组(1.67±0.47)；术后12周：A组(8.33±0.57)、B组 (8.67±0.47)、C组 (2.00±0.81)。统计学分析显示：A、B组与C组差异有统计学意义 (P＜0.05)，A组和B组间差异无统计学意义 (P＞0.05)。

图2 术后12周时可见A、B组骨缺损基本被骨组织所替代，骨与材料接触的边界基本消失，成骨可靠。C组12周见明显骨缺损区，无明显骨修复

2.2.2 CT影像学检查结果

Micro-CT扫描结果基本同X线，各组术后标本图像如(图3)所示，术后12周A、B两组均完成骨融合，骨皮质连续，材料与骨之间边界消失，髓腔内可见部分未降解材料。C组见缺损未修复。

图3 A、B两组可见骨皮质连续，骨缺损区基本修复，缺损中央见少部分材料未降解。C组见骨缺损未修复

2.3 组织学检查结果

术后4周时，阶梯缓释抗结核纳米人工骨和 -TCP材料对照组在骨缺损区域均可见有新生的幼稚骨小梁形成，周围大量成骨细胞存在，缺损边缘成骨量增加。植入材料部分降解，而移植区域未见明显炎性反应及巨噬细胞侵润。空白对照组骨缺损区可见大量增生的纤维组织，缺损区基地部有少许骨小梁形成；8周时，两材料组骨缺损区可见继续增多的新生骨小梁及骨样组织出现，较致密，软骨成骨明显。空白对照组骨缺损区可见少量未成熟的编织骨，但仍以纤维组织为主，形成骨痂由编织骨与纤维骨痂组成；12周时，两材料组缺损区可见到大量骨基质及胶原新生骨，骨细胞较为成熟，排列规则，材料降解。空白对照组骨缺损区较8周时变化不大(图4，彩图见插页)。Lanesandhu组织学评分：术后12周：A组 (9.67±0.58)分、B组 (10.67±0.58)分、C组(2.33±0.58)分。A、B组与C组差异有统计学意义(p＜0.05)，A组和B组间差异无统计学意义 (P＞0.05)。

图4 12周时，A、B组缺损区可见到大量骨基质及胶原新生骨，骨细胞较为成熟，排列规则，材料降解。C组见少量未成熟的编织骨，但仍以纤维组织为主

3 讨论

骨结核患者好发于脊柱、股骨远端、胫骨近端及膝关节等处。脊柱结核多对椎体造成破坏，形成死骨，需要手术切除植骨治疗，由于其病灶周围缺乏血供，全身用抗结核药物难以到达坏死灶内部形成有效的药物浓度，术后往往需要长时间(＞6月)药物治疗，出现药物不良反应几率增加，更易导致结核复发[2]。而股骨远端、胫骨近端等部位由骨细胞软骨细胞、致密胶原及糖蛋白基质共同构成，结核形成后自身修复相对困难[3]，同样也面临全身抗结核药物治疗到达病灶局部的药物浓度较低，甚至因血供不足药物无法到达病灶等问题。再加上常规剂量下病灶内低药物浓度容易产生耐药。为解决上述临床难题，有学者提出通过局部化疗的方式控制病灶内药物浓度治疗骨结核[4]。因此在进行植骨治疗的同时，兼顾局部结核化疗治疗，是我们研究的方向。文献报道抗结核药物一般最低杀菌浓度为最低抑菌浓度的10倍[5]。如何提高并定制合理的病灶局部药物浓度，使其达到杀灭细菌浓度，又能避免剂量过大造成的相关副作用，成为目前脊柱结核治疗研究的热点。病灶局搭载部缓释药物人工骨支架植入是当前理想的解决策略。因此我们设计出一种具有多种抗结核药物联合阶梯长效缓释的人工骨填充材料，在手术中植入清除的结核病灶区，能够在病灶内阶梯缓释抗结核药物并达到有效浓度，有利于骨结核的局部治疗，从而改良全身用药方案，减少药物用量、疗程等。最终减少患者相关并发症产生，提高骨结核病有效治愈率。

本实验制备的阶梯缓释抗结核纳米人工骨，旨在兼具抗结核治疗和骨移植治疗的双重作用。在药物释放方面，INH和REP我们使用PCL作为缓释载体，主要考虑其为可完全降解的高分子有机材料，有优良的生物相容性和药物通过性，便于和无机的骨支架材料结合，已广泛应用于药物的控释载体。PCL结晶度高，疏水性强，降解速度慢，一般用于长效药物载体。Rutledge等[6]用PCL作为托普霉素载体，安全有效的治疗了兔骨髓炎模型，长达4周时间。Shenoy等[7]用PCL制备了胰岛素微滴缓释系统，对糖尿病鼠进行治疗，通过检测，释药时间长达60天，且能保持胰岛素血浆浓度平稳。而抗结核药物同属于长程用药，因此本课题选用PCL作为药物控释载体。但在标准结核药物治疗方案中，SM用药时间相较INH、RFP短，再加上前部分实验我们发现链霉素属于非脂溶性药物，为水溶性药物，而水的挥发性不好，而导电性好，易放电，难以将链霉素水溶液调至一个最佳的纺丝比例，即使能够通过纺丝得到链霉素药膜，在人工骨去盐过程中也会把链霉素损失掉(用水浸泡去盐，链霉素为水溶性)，导致载药量达不到治疗效果。因此，我们采用SA作为SM载体。SA属天然有机高分子化合物，同样具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、粘性和安全性。在钙离子的作用下 SA可诱导产生自行组装[8,9]，海藻酸钠凝胶化的速度与钙盐的种类，钙离子耦合剂和溶液的酸碱度有关，通过调节以上三个因素，达到控制凝胶化的速度。将链霉素与SA其按一定浓度比例在无水氯化钙溶液中混合后可形成控释的SA抗结核药物微球。为实现可控释放及多药物阶梯释放，我们引用静电纺丝技术，将搭载抗结核药物的PCL制备成药物电纺膜，分层镀膜形成多层片释药系统，这种系统可以通过减少药物释放表面积及限制溶剂的渗透速度，延缓溶出介质对片芯的作用，从而达到控释的目的[10-12]。在实验中我们发现，SM 由于溶剂问题无法进行静电纺丝，遂制备成载药胶体。最终将INH、RFP/PCL电纺膜与SM/ SA胶体逐层压配至 -TCP形成复合人工骨支架材料。

在成骨性能方面，理想的药物载体材料应具备良好的生物相容性，不引起植入部位炎症反应；符合生物力学要求的机械强度及可塑性；特定的生物活性，有诱导新骨形成的功能等[13]。在此基础上，载体的孔径需要在100 m以上才有较好的成骨效能，同时满足生物可降解性。-TCP作为骨支架材料，在临床和各类实验研究均得到广泛应用，取得良好的经济效益和社会效益。该材料具有较强的细胞相容性，降解完全，能够与周围的正常的骨组织直接结合，达到可靠的骨修复作用[14]。本课题选用的奥林巴斯公司的 OSferion -TCP，是日本国内唯一一种以 -TCP为主要成分的骨修复材料。具有70%～80%孔隙率和5～20Mpa压缩强度，产品纯度高，微孔结构精密，孔径100～400 m，方便新骨和毛细血管长入支架，增大反应表面积，材料降解吸收与新骨生长同步。可根据需要来制成不同尺寸和孔径的材料。因此，本课题将 -TCP作为基础骨支架材料，用以复合缓释微球载体以及填补骨缺损，同时将其作为材料对照组。动物实验表明本材料的成骨性能可靠，成骨方式基本同 -TCP材料对照组。大体观察、影像学和组织学结果均显示阶梯缓释抗结核纳米人工骨材料在术后8周即出现明显成骨，材料与骨接触界面逐渐模糊，至12周可见明显骨填充缺损区域，界面接触的骨折线消失，载体基本降解完成。而空白对照组在12周时显示骨缺损区未修补，仅以纤维组织充填缺损区。通过动物实验证明静电纺丝法搭载多种抗结核药物人工骨材料具有良好成骨性能，搭载抗结核药物对人工骨成骨性能无明显影响。

本课题通过静电纺丝等技术制备出阶梯缓释抗结核纳米人工骨 -TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA复合体，通过动物实验论证该材料在搭载三联药物的同时具体良好的成骨性能，是临床上针对骨结核术后骨缺损治疗的一种理想的载药人工骨材料，为药物缓释机制的组织工程骨和炎性骨缺损的治疗提供新思路。

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Study on osteogenetic capacity of step-controlled-release anti-tubercu-losis drugs nanometer composite artificialbone

ObjectiveConstruct step-controlled-release anti-tuberculosis drugs with isoniazid, rifampicin, streptomycinnanometer artificial bone by the electrostatic spinning technique. Through the repair of rabbit femoral distal bone defectmodel, observe this material's osteogenesis performance.MethodsEstablish rabbits'distal femoral bone defect model. Fill in the defect area step-controlled-release anti-tuberculosis drugs nanometer artificial bone(-TCP/INH-RFP-PCL/ SM-SA)and set as group A.The defect implant-TCP set as control group B.C group is blank group do noting with bone defect.Get specimens after surgery at 4,8,12 weeks respectively.Through the methods of gross observation,X-ray, CT scan and histological examination on the specimens,determine -TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA's osteogenesis performance in vivo.ResultsThe gross and histological observation and X-ray showed -TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA experimentalgroup compared with blank has a good efficiency of osteogenesis. Compared to -TCP group osteogenesis efficiencyhas no obvious difference. Lane-sandhu histological and X-ray scores have shown: A/B and C group differencewas statistically significant ( ＜0.05), there was no statistically significant difference between the group A and group B( ＞0.05).Conclusion-TCP/INH-RFP-PCL / SM-SA has good bone conduction and bone regeneration, composite INH,RFP, SM anti-tb drugs will not affect the in vivo osteogenesis ability of the composite material.

Bone tuberculosis;Nano materials;Controlled-release;Electrostatic spinning;Bone defect

R318.08 [

]A

席焱海(1981-)男，研究生，主治医师。研究方向:组织工程，脊柱外科。

*[通讯作者]叶晓健(1964-)男，教授，主任医师。研究方向：脊柱外科，医学生物材料。

]何海龙（1973-）男，博士后，副教授，副主任医师。研究方向：脊柱外科，生物医学材料。

2014-04-11)

12nm 0501202阶梯缓释抗结核纳米人工骨构建及对成骨响应机制影响的研究，上海市科委纳米专项

1第二军医大学附属长征医院骨科医院脊柱外科，上海200003；2上海同济大学，上海200092

*[