实验性脑梗死后硫酸软骨素蛋白多糖的表达☆

陈歆然 叶兰香 廖松洁 龚琼 余剑

实验性脑梗死后硫酸软骨素蛋白多糖的表达☆

陈歆然*叶兰香*廖松洁*龚琼*余剑*

目的 观察高血压大鼠大脑皮质局灶梗死后病灶周围皮质及其同侧丘脑抑制性蛋白—硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs)的表达并探讨其对神经可塑性的可能作用。方法建立高血压大鼠的右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型，假手术(Sham)组仅暴露而不凝闭MCA，每组24只。MCAO或Sham后第7天和第14天，各组各时间点取12只大鼠按改良神经功能缺损评分(modified neurological severity scores,mNSS)进行神经功能评分后，处死取脑，免疫荧光及western bolt检测梗死灶周围皮质及其同侧丘脑CSPGs及其组分NG2、Neurocan的表达。结果MCAO后大鼠出现不同程度的神经功能缺损；MCAO术后第7天梗死灶周围皮质及其同侧丘脑CSPGs、NG2及全长Neurocan与Sham组相比表达均增加，并持续至第14天(P＜0.05)，但第7天与第14天的表达相比无统计学差异(P＞0.05)；术后第7天和第14天C端片段的Neurocan在上述部位的表达无统计学差异(P＞0.05)。结论CSPGs可能通过提供抑制性环境参与脑梗死后病灶局部及远隔丘脑的神经可塑性。

硫酸软骨素蛋白多糖 脑梗死 丘脑 神经可塑性

硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs)是一组由神经元、胶质细胞等合成并分泌的共价结合硫酸糖胺聚糖链蛋白，其成员众多，Neurocan和NG2是CSPGs家族中两个主要组分[1-2]。成年CNS损伤后，CSPGs在病灶周围内表达大多显著上调，在细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)内形成抑制性环境，阻碍神经再生[3]。目前针对CNS损伤后CSPGs的研究大多采用脊髓损伤模型，对卒中后CSPGs的表达研究较少，且尚无结合梗死灶局部及远隔丘脑的研究。在本研究中，我们观察高血压大鼠一侧大脑皮质梗死后病灶周围皮质及同侧丘脑CSPGs及NG2、Neurocan的表达，并探讨其对CNS可塑性的可能作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备按双肾双夹法复制Sprague-Dawley大鼠(广东省医学动物中心)易卒中型肾血管性高血压模型[4]。术后12周，随机选取24只血压稳定在180mmHg以上，无自发性卒中症状的大鼠，其中12只制备右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型[5]。其余12只仅暴露而不凝闭MCA，作为假手术(Sham)组。术前1天及术后第7、14天各组大鼠按mNSS法行神经评分[6]。

1.2 脑组织准备手术后第7天和第14天，选取MCAO组和Sham组各12只大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉，其中6只经升主动脉4%多聚甲醛灌注固定，快速断头取脑，后固定8 h，O.C.T包埋，经丘脑层面冠状冰冻切片，片厚10µm；其余6只大鼠经升主动脉灌注4℃生理盐水，快速断头取脑，置于液氮中保存备用。

1.3 免疫荧光取冰冻切片行免疫荧光法检测。一抗分别为单克隆小鼠抗大鼠CSPGs(1:400,Sigma)、NG2(1:500,Chemicon)、Neurocan(1:500,Chemicon)抗体。次日滴加Alexa Fluor 594驴抗小鼠(1: 500,Invitrogen)的二抗，室温孵育1h，水溶性封片剂封片，荧光显微镜观察CSGP、NG2及Neurocan的表达水平。

1.4 Western Blot取梗死灶周围皮质及同侧丘脑，采用组织裂解法提取蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品进行SDS-PAGE垂直电泳，每孔50 µg。转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入单克隆小鼠抗大鼠NG2(1:1000)、Neurocan (1:1000)抗体，4℃摇床过夜，次日加入偶联辣根过氧化物的山羊抗小鼠抗体(1:2000,Chemicon)，室温摇床1 h，Millipore发光液中感光盒内曝光。采用Image J软件进行图像分析，目的蛋白条带与β-actin的吸光度比值即为目的蛋白的相对值。

1.5 统计学方法采用SPSS13.0分析数据，计量数据以（）表示。两组数据间比较采用t检验；多组数据间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。检验水准ɑ=0.05。

2 结果

2.1 神经功能评分两组大鼠mNSS基线评分相等。Sham组后第1、7及14天，mNSS评分显示大鼠运动、感觉及平衡等功能均正常。与Sham组相比，MCAO组后第1、7及14天mNSS评分较Sham组明显增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。MCAO组大鼠运动、感觉及平衡等功能不同程度受损(图1)。

2.2 免疫荧光Sham组大鼠皮质及同侧丘脑CSPGs、NG2及Neurocan均无明显表达。MCAO后第7天，CSP-Gs(图2)、NG2(图3)及Neurocan(图4)在梗死灶周围皮质及同侧丘脑表达均增加，并持续至第14天。其中可见梗死灶周围皮质的阳性值较同侧丘脑多，但第7天与第14天相比，表达无明显差异。

2.3 Western blotSham组大鼠皮质及同侧丘脑NG2呈轻度表达。与Sham组相比，MCAO后第7天和第14天梗死灶周围皮质及同侧丘脑NG2表达明显增加(P＜0.05)。Sham组大鼠皮质及同侧丘脑Neurocan的表达有两种趋势：其中一个分子量约为245KD的全长Neurocan无明显表达，另一个分子量约为180KD的C端片段Neurocan呈中度表达；与Sham组相比，MCAO后第7天和第14天梗死灶周围皮质及同侧丘脑全长的Neurocan表达明显增多(P＜0.05)；而C端片段Neurocan表达无明显差异(P＞0.05)(图5)。

3 讨论

图2 Sham/MCAO后第7和第14天CSPGs在梗死灶周围皮质及同侧丘脑的表达。A:Sham组皮质；B:MCAO组第7天梗死灶周围皮质；C:MCAO组第14天梗死灶周围皮质；D:Sham组同侧丘脑；E: MCAO组第7天同侧丘脑；F:MCAO组第14天同侧丘脑。标尺=40 µm

图3 Sham/MCAO后第7和第14天NG2在梗死灶周围皮质及同侧丘脑的表达。A:Sham组皮质；B:MCAO组第7天梗死灶周围皮质；C:MCAO组第14天梗死灶周围皮质；D:Sham组同侧丘脑；E: MCAO组第7天同侧丘脑；F:MCAO组第14天同侧丘脑。标尺=40 µm

图4 Sham/MCAO组后第7和第14天Neurocan在梗死灶周围皮质及同侧丘脑的表达。A:Sham组皮质；B:MCAO组第7天梗死灶周围皮质；C:MCAO组第14天梗死灶周围皮质；D:Sham组同侧丘脑；E:MCAO组第7天同侧丘脑F:MCAO组第14天同侧丘脑。标尺=40µm

本研究发现，一侧大脑皮质梗死后第7天和第14天，梗死灶周围皮质及同侧丘脑CSPGs、NG2、全长Neurocan不同程度表达增加，C端片段Neurocan表达无明显差异。CSPGs、NG2、全长Neurocan的表达上调与MCAO后神经功能缺失存在时间上的一致性，提示CSPGs可能通过提供抑制性环境参与脑梗死后病灶局部及远隔丘脑的神经可塑性。

胶质疤痕的形成是CNS损伤的病理学标志，其在病灶和周围正常组织之间形成一道机械屏障，具有限制炎症反应和减轻损伤的作用，但同时也直接阻碍了损伤后的神经再生[7]。在胶质疤痕中，CSPGs作为ECM的主要成分，被认为起重要的抑制作用[8]。成年大鼠大脑皮层损伤后，病灶周围形成的胶质疤痕内，CSPGs、NG2、Neurocan的表达在4周内均不同程度上调[9]；Jones等[10-11]发现成年大鼠脊髓损伤后，病灶周围NG2及Neurocan表达明显上调，并持续至4周，形成ECM内的主要抑制性环境，阻碍神经再生。我们的实验结果也表明，MCAO后，CSPGs、NG2及Neurocan不同程度表达上调，并持续至2周。与上述的研究结果具有不同程度的一致性；同时我们还发现，CSPGs、NG2、Neurocan在其同侧丘脑部位的表达与Sham组相比也明显增加。鉴于MCAO术后仅大脑半球的顶叶、额叶皮质出现病变而脑深部结构包括丘脑未受累及，说明丘脑CSPGs、NG2及Neurocan的表达上调是继发于大脑皮质局灶梗死后的，提示除了梗死灶局部原发损害外，远隔部位的继发性损害也值得关注。此外，本研究还观察到Neurocan的全长和C端片段表达趋势不一：前者在Sham组无明显表达，而梗死后表达明显升高；后者的表达与Sham组相比无明显差异性。对于这种结果的解释，已有研究表明，全长Neurocan在发育的大脑中表达较多而在成年正常大脑中检测不到，但其表达在CNS损伤后再次上调；而其C端片段的表达量不受CNS损伤的影响，表达较保守[12]。提示全长Neurocan可能参与损伤后的抑制性作用，而C端片段可能为一种结构性成分。

图5 Sham/MCAO组后第7和第14天NG2、Neurocan在梗死灶周围皮质及同侧丘脑的表达(A)及半定量(B)。＊与Sham组皮质比较，P＜0.05；#与Sham组丘脑比较，P＜0.05

一般认为，CSPGs的抑制性作用主要取决于其侧链。在CNS损伤后病灶局部应用CSPGs特异性侧链降解剂—软骨素酶ABC后，神经轴突再生明显增强，同时伴有神经功能的改善[13-14]，提示CSPGs的表达增高是CNS损伤后神经再生和功能突触形成的不利因素之一；结合本研究一侧大脑皮层梗死后梗死灶周围皮质及远隔丘脑CSPGs及NG2、Neurocan表达增高，并与神经功能缺失存在时间上的一致性，提示CSPGs可能参与了脑梗死后梗死灶局部及远隔丘脑的神经可塑性。

[1] Kwok JC，Afshari F，Garcia-Alias G，et al.Proteoglycans in the central nervous system:plasticity,regeneration and their stimulation with chondroitinase ABC[J].Restor Neurol Neurosci，2008，26(2-3):131-145.

[2] Rhodes KE，Fawcett JW.Chondroitin sulphate proteoglycans: preventing plasticity or protecting the CNS?[J].J Anat，2004，204(1):33-48.

[3] Galtrey C，Fawcett J.The role of chondroitin sulfate proteoglycans in regeneration and plasticity in the central nervous system [J].Brain Research Reviews，2007，54(1):1-18.

[4] Zeng J，Zhang Y，Mo J，et al.Two-Kidney，Two Clip Renovascular Hypertensive Rats Can Be Used as Stroke-prone Rats[J]. Stroke，1998，29(8):1708-1714.

[5] Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Ratmiddle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke，1986，17(3):472-476.

[6] Chen J，Li Y，Wang L，etal.Therapeutic Benefit of Intravenous Administration of Bone Marrow Stromal Cells After Cerebral Ischemia in Rats[J].Stroke，2001，32(4):1005-1011.

[7] Rolls A，Shechter R，Schwartz M.The bright side of the glial scar in CNS repair[J].NatRev Neurosci，2009，10(3):235-241.

[8] Fawcett JW.Overcoming inhibition in the damaged spinal cord [J].JNeurotrauma，2006，23(3-4):371-383.

[9] Carmichael S，Archibeque I，Luke L，et al.Growth-associated gene expression after stroke:evidence for a growth-promoting region in peri-infarct cortex[J].Exp Neurol，2005，193(2):291-311.

[10] Jones LL，Yamaguchi Y，Stallcup WB，et al.NG2 is a major chondroitin sulfate proteoglycan produced after spinal cord injury and is expressed bymacrophages and oligodendrocyte progenitors[J].JNeurosci，2002，22(7):2792-2803.

[11] Jones L.The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan,brevican,phosphacan,and versican are differentially regulated following spinal cord injury[J].Exp Neurol，2003，182(2):399-411.

[12] Deguchi K，TakaishiM，Hayashi T，et al.Expression of neurocan after transientmiddle cerebral artery occlusion in adult rat brain[J].Brain Res，2005，1037(1-2):194-199.

[13] Bradbury EJ，Moon LD，Popat RJ，et al.Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury[J].Nature，2002，416(6881):636-640.

[14] Carter LM，McMahon SB，Bradbury EJ.Delayed treatmentwith Chondroitinase ABC reverses chronic atrophy of rubrospinal neurons following spinal cord injury[J].Exp Neurol，2011，228 (1):149-156.

The expression of chondroitin sulfate proteoglycans after focal cerebral infarction in hypertensive rats.

CHEN Xinran,YE Lanxiang,LIAO Songjie,GONG Qiong,YU Jian.
Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China.Tel:020-87332200.

ObjectiveTo examine the expression of inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans(CSPGs)and investigate their potential effects on neural plasticity in the peri-infarct cortex and ipsilateral thalamus after focal cerebral infarction in hypertensive rats.MethodsTwenty-four adult renovascular hypertensive Sprague-Dawley rats per group were subjected to permanent rightmiddle cerebralartery occlusion(MCAO)or sham operation.Twelve ratswhich were selected randomly from per group at each time pointwere decapitated and their brainswere removed and cut into coronal sections at7 and 14 days postMCAO.The expression of CSPGs,NG2 and Neurocan was examined using immunostaining and western blot.ResultsAll rats displayed neurological deficits to varying degrees and the expression of CSPGs,NG2 and full length Neurocan was increased in the peri-infarct cortex and ipsilateral thalamus at 7 and 14 days(P＜0.05). However,there were no significant difference in either expression of CSPGs,NG2 and full-length Neurocan between 7 and 14 days or the expression of C-terminal fragment Neurocan at 7 and 14 days(allP＞0.05).ConclusionsCSPGsmay play a negative role in neural plasticity through induction of inhibitory environment in the peri-infarct cortex and ipsilateral thalamus follo wing focal cerebral infarction in hypertensive rats.

CSPGs Cerebral infarction Thalamus Neural plasticity

R743.3

A

2013-10-26）

（责任编辑：李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.04.004

☆国家自然科学基金（编号：81371276）；国家自然科学基金青年项目（编号：81100871）；中山大学培育青年教师基金（编号：09ykpy48）

*中山大学附属第一医院神经内科（广州 510080）