法舒地尔联合谷氨酸降低胶质瘤细胞存活率☆

陈舒 罗铭 蔡望青 何明亮 陈美惠 刘安民

法舒地尔联合谷氨酸降低胶质瘤细胞存活率☆

陈舒*罗铭**蔡望青*何明亮*陈美惠△刘安民*

目的 观察Rho激酶抑制剂法舒地尔对胶质瘤细胞NMDAR-1表达和联合谷氨酸降低细胞存活率。方法使用法舒地尔干预原代人脑胶质瘤细胞48h后再加入谷氨酸共同培养细胞24h。相差显微镜观察法舒地尔对细胞形态变化的影响；噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的存活率；免疫荧光和蛋白质印迹检测谷氨酸受体的表达变化。结果经过法舒地尔干预48h后，免疫荧光（NMDAR-1阳性细胞百分比计数：空白对照组18.9%±3.7%,Fas100μmol/L组79.4%±6.4%,P＜0.05）和蛋白质印迹表明谷氨酸受体的表达明显升高（Fas50μmol/ L组相对密度：Blank组4.07±1.04倍，P＜0.05，Fas100μmol/L组为4.89±0.96倍，P＜0.05），谷氨酸能明显降低经法舒地尔处理后的细胞的存活率（空白对照组与空白对照+谷氨酸组吸光度分别为1.47±0.11和1.34±0.20，P＞0.05；Fas50μmol/L组和Fas50μmol/L+谷氨酸组为0.98±0.16和0.66±0.15，P＜0.05；Fas100μmol/L组和Fas100μmol/ L+谷氨酸组为0.89±0.13和0.49±0.17，P＜0.05）。结论法舒地尔可以诱导人脑胶质瘤细胞谷氨酸受体的表达增高，从而可以联合谷氨酸发挥谷氨酸兴奋性毒性达到更好的抗胶质瘤的作用。

法舒地尔 胶质瘤 谷氨酸 NMDAR-1

脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发肿瘤，目前对于胶质瘤的治疗仍然不能取得满意的疗效。目前对于胶质瘤的治疗已经有了很多发现，其中法舒地尔作为唯一应用于临床上的Rho激酶抑制剂被广泛应用于蛛网膜下腔出血、脑缺血等中枢神经系统疾病的治疗中[1,2]。近年来的研究发现[3,4]，法舒地尔可明显诱导胶质瘤细胞株的细胞凋亡、抑制胶质瘤细胞的生长。N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)是细胞谷氨酸受体的一种亚型，能引起钙离子通道开放，钙离子内流使得细胞内钙离子超载，造成细胞凋亡[5]，这可能作为胶质瘤治疗的一个新的靶点[6]。但是人脑胶质瘤细胞缺乏谷氨酸受体[7-9]，因此如何增强胶质瘤细胞中谷氨酸受体的表达使之成为治疗靶点是目前急需解决的问题。原代培养的脑胶质瘤细胞保留原来的遗传特性,最接近和反映体内生长特性,是理想的基因表达和药物毒性体外试验模型[10]。因此，在本研究中我们应用法舒地尔诱导人脑胶质瘤原代细胞表达NMDAR-1的情况，并联合谷氨酸探讨抗胶质瘤的可能作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料人脑胶质母细胞瘤标本来自中山大学孙逸仙纪念医院神经外科，术前经患者知情同意，术后病理诊断为胶质母细胞瘤（WHOⅣ）。DMEM培养基，胎牛血清（Gibco公司）；二甲基亚砜（DMSO），Hochest 33258，谷氨酸（Glu）和噻唑蓝（MTT）（美国Sigma公司，谷氨酸纯度＞98%）；法舒地尔（大连美伦，纯度＞98%）；兔多克隆抗NMDAR1抗体（武汉博士德）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗（Thermo Scientific公司）；Alexa 555标记山羊抗兔IgG二抗，青霉素-链霉素，RIPA裂解液，TritonX-100（碧云天）；PVDF膜（Millipore公司）；激光共聚焦显微镜，CK2型倒置相差显微镜（Olympus，日本）；酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 人脑胶质母细胞瘤标本进行细胞培养取下标本后1h内浸泡在含1%青霉素-链霉素的PBS中，小心去除组织上的血管、脑膜等非肿瘤组织。将组织剪成大小约为1cm3的小块，0.25%胰酶消化10～15min。吸取上清，向上清液中加入含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMED培养液，1200 r/min离心5min后弃上清，加入相同培养液重悬细胞。将细胞以每毫升105个密度接种于培养瓶中，置于5%CO2、37℃的恒温箱中培养24h后换液，当细胞密度达到90%融合度时传代。

1.3 法舒地尔干预胶质瘤细胞将细胞接种到48孔板上，培养24h后分别加入不同浓度的法舒地尔（F）处理细胞，设立空白对照组（单纯DMEM）、法舒地尔50μmol/L、法舒地尔100μmol/L，并每组设立2个副孔，48h后镜下观察细胞形态学的变化。

1.4 MTT比色法检测胶质瘤细胞的存活率人脑胶质母细胞瘤细胞以2×103个/孔接种于96孔板上，24h后用含不同浓度的法舒地尔（0，50，100 μmol/L）的DMEM培养液培养细胞48h，每个浓度设12个孔培养细胞。取各浓度6个孔加入50 mmol/L的谷氨酸溶液1μL，使谷氨酸终浓度为500μmol/L，其余6个孔加入1μL PBS继续培养细胞24h，每组有6个副孔。向各孔加入5g/L,10μL的MTT溶液培养4h，然后小心吸去液体，向每孔中加入100μL DMSO，15 min后用酶标仪在570 nm下检测吸光度（OD值）。

1.5 WesternBlot检测NMDAR-1的表达将不同浓度的法舒地尔与人脑胶质母细胞瘤细胞培养48h后，吸去上清液，用PBS洗3次，加入RIPA裂解液提取蛋白。最终蛋白上样量为20μg，用8%分离胶进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺(SDS—PAGE)凝胶电泳后，将蛋白转膜到PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭1h，用兔多克隆抗NMDAR-1抗体（1：400稀释）4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次5min，再将膜置入HRP标记山羊抗兔IgG二抗(1：10000稀释)室温反应1 h。洗膜后用增强化学发光(ECL)法在显影仪下显影。Western Blot条带应用Quantity One软件进行灰度分析。

1.6 免疫荧光检测细胞连接处NMDAR-1的表达法舒地尔培养细胞48h后，吸去培养液，用PBS洗3次。用4%多聚甲醛室温固定细胞15min，PBS洗净多聚甲醛后加入0.3%TritonX-100透膜15min。洗净TritonX-100，加入正常山羊血清室温封闭1h，再加入兔多克隆抗NMDAR-1抗体（1：200稀释）4℃孵育过夜。吸去NMDAR-1抗体，PBS洗3次，避光加入Alexa 555标记山羊抗兔IgG二抗（1：500稀释）室温1h，PBS洗净抗体，加入Hochest 33258（1：1000稀释）室温10min，用PBS洗净细胞。封片，上机检测。随机选取3个视野进行NMDAR-1阳性细胞计数，计算阳性细胞所占比例。

1.7 统计学处理应用SPSS 13.0分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示。单因素方差分析(Oneway ANOVA)进行组间数据比较，两组之间比较用Dunnett’t检验，检测水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同法舒地尔浓度对胶质瘤细胞形态的影响法舒地尔培养胶质瘤细胞72h后，细胞胞体变细、变圆、变小，细胞核固缩数量增加，皱褶增多，细胞突起增多且纤细，并且细胞间的连接增多。这种变化具有浓度依赖性，法舒地尔高浓度（100 μmol/L）较稍低浓度（50μmol/L）的细胞形态学的改变更加显著，见图1。

2.2 谷氨酸降低经法舒地尔处理后细胞的存活率MTT法检测显示，空白对照组吸光度OD值（1.47± 0.11）与空白对照+谷氨酸组（1.34±0.20）相比，无明显变化（P＞0.05）；而法舒地尔50μmol/L+谷氨酸组OD值（0.66±0.15）与法舒地尔50μmol/L组OD值（0.98±0.16）相比明显下降（P＜0.05）；法舒地尔100μmol/L+谷氨酸组OD值（0.49±0.17）与法舒地尔100μmol/L组OD值（0.89±0.13）相比明显下降（P＜0.05）。并且与空白对照组相比，法舒地尔50μmol/L组（P＜0.05）和法舒地尔100μmol/L组的OD值明显下降（P＜0.05）。

2.3 法舒地尔对胶质瘤细胞谷氨酸受体NMDAR-1蛋白的影响经法舒地尔100μmol/L作用于胶质瘤细胞48h后做Western blot检测谷氨酸受体NMDAR-1表达的变化，结果显示：Fas 50μmol/L组相对密度为空白对照（Blank）组4.07±1.04倍（P＜0.05），Fas 100μmol/L组为4.89±0.96倍（P＜0.05），见图2。

2.4 免疫荧光检测高浓度法舒地尔对谷氨酸受体NMDAR-1的表达变化空白对照组（Blank）中细胞内NMDAR-1的表达量十分低，经法舒地尔100μmol/L(Fas 100)处理48h后的胶质瘤细胞中NMDAR-1的表达明显增高，尤其是在细胞连接处的表达增高明显。这与Western blot的结果相一致，见图3。NMDAR-1阳性细胞百分比计数结果为：Fas 100μmol/L组79.4%±6.4%较空白对照组18.9%±3.7%明显升高（P＜0.05）。

3 讨论

研究发现，Rho/ROCK通路在细胞活动如细胞骨架的重构、细胞分化和迁徙、细胞凋亡中发挥着重要的作用[1,2,11]。ROCK(Rho kinase)的过度激活可导致多种疾病，ROCK的抑制能逆转各自病理过程，因此对ROCK抑制剂的研究有着重要的意义，而法舒地尔是目前临床上惟一可用的ROCK抑制剂。

Rho/ROCK信号通路是胶质瘤发生的重要机制之一。ROCk有两个亚型，即ROCK 1和ROCK 2，在胶质瘤组织中，两者的表达较正常脑组织中高，并且ROCK 1和ROCK 2在胶质瘤的增殖、迁移、侵袭过程中发挥着不同的作用。其中选择性抑制ROCK 1能降低胶质瘤细胞的迁移和增殖，而抑制ROCK 2能加强抑制ROCK 1所起到的抑制胶质瘤细胞增殖的作用[12]。作为ROCK抑制剂，法舒地尔可以同时抑制ROCK 1和ROCK 2，从而发挥抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用[4]。在本实验中，胶质瘤细胞经过法舒地尔处理48h后，应用MTT法检测细胞存活率发现，与对照组相比，单纯法舒地尔组能够明显降低胶质瘤细胞的存活率(P＜0.05)。

目前有研究表明，谷氨酸能够通过作用于细胞膜上NMDAR引起钙离子通道开放，钙离子内流使得细胞内钙离子超载，造成细胞凋亡[5]。作为谷氨酸信号通路中最重要的组成成分NMDAR，最初被发现与突触的可塑性和记忆密切相关[13]。近期研究认为谷氨酸相关的信号通路可能是治疗肿瘤的一个新的靶点[6]。由于人脑胶质瘤细胞中NMDAR的表达量很低[7]，因此谷氨酸无法对胶质瘤细胞发挥兴奋性毒性引发细胞凋亡。胶质瘤细胞自身可以分泌谷氨酸使肿瘤周围正常的胶质细胞和神经元细胞死亡[14]，从而更好的发挥自身的侵袭性。鉴于此，如果可以诱导人脑胶质瘤细胞中NMDAR的表达增高，则细胞自身分泌的谷氨酸也会对本身造成杀伤，同时NMDAR也可以作为杀伤胶质瘤细胞的一个可能的治疗靶点。

图1 不同浓度法舒地尔对胶质瘤细胞形态学的影响。Blank：空白对照组；Fas 50:法舒地尔50μmol/L组；Fas 100:法舒地尔100μmol/L组。放大倍数200×，标尺50μm

图2 法舒地尔对胶质瘤细胞谷氨酸受体NMDAR-1蛋白的影响。Blank：空白对照组；Fas 50:法舒地尔50μmol/L组；Fas 100:法舒地尔100μmol/L组，n=3

图3 疫荧光检测高浓度法舒地尔谷氨酸受体NMDAR-1的表达变化。Blank：空白对照组；Fas100:法舒地尔100μmol/L组，n=3

本研究中，我们通过蛋白质印迹和免疫荧光检测发现经法舒地尔处理后的NMDAR-1的表达明显增高，并且MTT法检测细胞存活率发现，向经法舒地尔处理后的细胞中加入谷氨酸能进一步的降低细胞的存活率(P＜0.05)，而谷氨酸无法影响未经法舒地尔处理的细胞存活率。由此我们推断，法舒地尔能够诱导胶质瘤细胞中NMDAR-1的表达增高(P＜0.05)，克服了NMDAR作为胶质瘤治疗靶点的最大阻碍，从而可以联合谷氨酸的兴奋性毒性发挥更好的抗胶质瘤的作用。因此，本研究结果提示，法舒地尔可以诱导人脑胶质瘤细胞谷氨酸受体的表达增高，联合谷氨酸发挥谷氨酸兴奋性毒性达到更好的抗胶质瘤的作用，NMDAR可能是胶质瘤治疗的靶点之一。

[1] Chen M,Liu A,Ouyang Y,et al.Fasudil and its analogues:a new powerful weapon in the long war against central nervous system disorders?[J].Expert Opin Investig Drugs，2013,22(4): 425-438.

[2] 陈美惠，刘安民，巢晓娟，等.Rho激酶抑制剂法舒地尔对中枢神经系统疾病作用及其结构改造的研究进展[J].中国新药杂志.2013,22(1):59-67.

[3] Yamaguchi S,Tanabe K,Takai S,et al.Involvementof Rho-kinase in tumor necrosis factor-alpha-induced interleukin-6 release from C6 glioma cells[J].Neurochem Int，2009,55(6):438-445.

[4] Deng L,Li G,Li R,et al.Rho-kinase inhibitor,fasudil,suppresses glioblastoma cell line progression in vitro and in vivo [J].Cancer Biol Ther，2010,9(11):875-884.

[5] Deiva K,Geeraerts T,Salim H,et al．Fraetalkine reduces N-methyl-d-aspartate-induced calcium flux and apoptosis in human neurons through extraeellular signal-regulated kinase activation[J].Eur JNeurosci,2004,20(12):3222-3232.

[6] Willard SS,Koochekpour S.Glutamate Signaling in Benign and Malignant Disorders:Current Status,Future Perspectives,and Therapeutic Implications[J].Int JBiol Sci，2013,9(7):728-742.

[7] Lyons SA,Chung WJ,Weaver AK,et al.Autocrine glutamate signaling promotes glioma cell invasion[J].Cancer Res,2007, 67(19):9463–9471.

[8] Roesler R,Brunetto AT,Abujam ra AL,et al.Current and emerging molecular targets in glioma[J].Expert Rev.Anticancer Ther,2010,10(11):1735–1751.

[9] Vanhoutte N,Hermans E.Glutamate-induced glioma cellproliferation is prevented by functional expression of the glutamate transporter GLT-1[J].FEBSLett,2008,582(13),1847–1852.

[10] 檀艳丽,方川,王雷鸣,等.人脑胶质瘤原代细胞培养及形态学观察[J].中国神经精神疾病杂志,2010.36(8):501-503.

[11] Shi J,Wei L.Rho kinase in the regulation of cell death and survival[J].Arch Immunol Ther Exp(Warsz),2007,55(2):61-75.

[12] Sonja Mertsch,Solon Thanos.Opposing Signaling of ROCK1 and ROCK2 Determines the Switching of Substrate Specificity and the Mode ofMigration of Glioblastoma Cells[J].Mol Neurobiol,2014,49（2）：900-915.

[13] Li F,Tsien JZ.Memory and the NMDA receptors[J].N Engl J Med,2009,361(3):302-303.

[14] Malarkey EB,Parpura V.Mechanisms of glutamate release from astrocytes[J].Neurochem Int,2008,52(1-2):142-154.

R394.2

A

2014-02-25）

（责任编辑:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.06.010

☆广东省科技社会发展项目（编号：2012B031800356）资助

*中山大学孙逸仙纪念医院神经外科（广州510120）

**肿瘤科

△中山大学药学院药理学与毒理学实验室