女贞子对MPP+诱导的PC12细胞氧化应激损伤保护作用研究

徐希娟，杨中林

(中国药科大学 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，江苏 南京 210009)



女贞子对MPP+诱导的PC12细胞氧化应激损伤保护作用研究

徐希娟，杨中林*

(中国药科大学 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，江苏 南京 210009)

目的：探讨女贞子是否对MPP+诱导的PC12细胞氧化应激损伤具有保护作用。方法：采用MPP+诱导的PC12细胞作为帕金森病体外模型，同时给予不同浓度的女贞子醇提液、水提液。通过MTT法测定细胞存活率，通过超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)及乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒来检测女贞子对细胞氧化应激损伤的影响。结果：与正常组相比，模型组细胞的细胞存活率显著下降，SOD抑制率、NO含量、MDA含量及LDH水平显著升高(P<0.01)；与模型组相比，浓度为1mg/mL的女贞子水提液显著提高细胞存活率，显著降低SOD抑制率、NO含量、MDA含量及LDH水平。结论：女贞子水提液对细胞的氧化应激损伤具有一定的保护作用。

女贞子；PC12细胞；MPP+；氧化应激损伤

帕金森病(Parkinson disease，PD)是指通过病史或客观检查找不出能够解释那些临床症状原因的疾病，其症状和体征通常是两侧不对称的，同时对多巴胺治疗有效，也称原发性帕金森病[1]。近年来研究证明，中脑黑质部位氧化应激反应增强及抗氧化保护机制减弱可能是引起发病的重要机制之一[2]。女贞子提取液能明显地改善D-半乳糖引起的衰老小鼠学习和记忆能力，具有提高抗氧化酶活性、清除自由基、减少氧化脂质生成的作用[3]。而氧化应激在帕金森病的发病机制中起着重要的作用，故推测女贞子对抗帕金森病具有一定的作用。本实验以MPP+诱导的PC12细胞为模型，探索女贞子对其是否具有保护作用，为其应用于帕金森病的防治提供依据。

1 材料与试药

1.1 实验仪器

Forma311系列直热式CO2培养箱(Thermo Electron Corporation，USA)，超净工作台(苏州艾可林净化设备有限公司)，COIC XDS-1B型倒置光学显微镜(重庆光电仪器有限公司)，Synergy2型酶标仪(Biotek公司)，TGL-16型高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司)，YXQ-SG41-280型电热提压力蒸汽消毒器(上海医用核子仪器厂)，TB-25型十万分之一电子天平(Sartorius，USA)。

1.2 细胞株

PC12细胞，中国医学科学院基础医学研究所惠赠。

1.3 药物与试剂

女贞子药材(购于江苏省南京市先声再康药业，经本人鉴定为木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实)，MPP+iodide(Sigma公司，产品编号81512)，DMEM高糖培养基(GBICO，批号1031719)，四季青胎牛血清(四季青公司，批号110419)，胰蛋白酶(GIBCO，批号27250018)，二甲基亚砜(南京化学试剂有限公司，批号P1059733)，Western 及IP细胞裂解液(碧云天生物技术研究所，批号P0013)。

1.4 试剂盒

SOD试剂盒(南京建成生物技术有限公司，批号20130928)；MDA剂盒(南京建成生物技术有限公司，批号20130925)；LDH试剂盒(南京建成生物技术有限公司，批号20131008)；NO试剂盒(南京建成生物技术有限公司，批号20130930)。

2 实验方法

2.1 样品液及试剂配制

2.1.1 样品液的制备 取女贞子药材10g，加10倍量水浸泡2h，10、9、8倍量蒸馏水直火煎煮3次，分别煎煮2.5、2.0、1.5h，合并提取液，浓缩，减压干燥后得水提物。取女贞子药材10g，加10倍量70%的乙醇浸泡2h，10、9、8倍量70%的乙醇85℃回流3次，分别回流2.5、2.0、1.5h，合并提取液，回收乙醇，减压干燥后得醇提物。称取上述两种提取物适量，给药前用DMEM高糖培养基制成浓度分别为1、0.1、0.01mg/mL的样品溶液。

2.1.2 MPP+溶液的配制 称取一定量MPP+iodide，加入10mL的DMEM高糖培养基，涡旋溶解，得浓度为20mmol/L的MPP+母液，用无菌滤膜过滤，置冰箱内-20℃保存，备用。

2.1.3 普拉克索溶液的配制 精密称取一定量普拉克索粉末，用DMEM高糖培养基溶解，得浓度为1×10-2mol/L的母液，用无菌滤膜过滤，置冰箱内保存，备用，使用时用培养液稀释到相应的浓度。

2.2 细胞培养

采用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，在5%CO2、37℃恒温恒湿培养箱中培养，每3～4天传代1次。

2.3 细胞活性的测定

将PC12细胞以3×104cell/mL的密度接种于96孔板，每孔200μL，培养24h后给药。实验组分别加入浓度为1、0.1、0.01mg生药/mL的水提物与70%醇提物，阳性药组加入等体积终浓度为1×10-7mol/L的普拉克索，空白对照组加入等体积的DMEM高糖培养基；除空白组，每组加入终浓度为2mmol/L的MPP+溶液；每组均设6个复孔。继续培养44h，每孔加入浓度为5mg/mL的MTT溶液20μL，37℃孵化4h，有蓝紫色沉淀生成。吸去培养液，每孔加入150μL/孔DMSO溶解，振荡摇匀10min，置酶标仪上570nm处测各孔光吸收值OD。

2.4 氧化应激水平测定

将PC12细胞以5×104cell/mL密度接种于24孔培养板，每孔1mL，培养24h后给药。实验组分别加入浓度为1mg生药/mL的水提物与70%醇提物，阳性药组加入等体积终浓度为1×10-7mol/L的普拉克索溶液，空白对照组加入等体积的不含血清的DMEM高糖培养基；除空白组，每组加入终浓度为2mmol/L的MPP+溶液；每组均设3个复孔，继续培养48h。细胞培养48h后，将板取出，从各孔中精密吸取培养液，按照NO、LDH试剂盒进行检测。细胞上清取完之后，弃去剩余培养液，用4℃预冷的PBS洗涤2次，加入裂解液100μL，在冰上裂解30min，收集裂解液，按SOD、MDA试剂盒分别进行测定。

2.5 统计学分析

3 实验结果

3.1 细胞活性测定

由表1可知，经MPP+诱导后细胞存活率极显著降低，说明造模成功。1mg/mL的水提物与70%乙醇提取物明显能提高细胞活性，细胞存活率显著高于模型组(P<0.05)，其它各浓度的女贞子提取物对PC12细胞的活性无显著保护作用。阳性药组细胞存活率低于女贞子组，说明1mg/mL的水提物与70%乙醇提取物能提高PC12细胞活性，且作用优于阳性药普拉克索。

3.2 氧化应激水平测定

由表2可知，模型组各指标与正常组相比具有显著性差异，说明造模成功。1mg/mL的女贞子水提物能显著性减小SOD抑制率，降低MDA、NO与LDH含量及水平，70%乙醇提取物只能显著性降低MDA含量。阳性药组只有MDA与NO显著降低。实验结果说明1mg/mL的女贞子水提物能够抗氧化应激，且其作用优于阳性药普拉克索。

表1 女贞子各提取物对PC12细胞存活率的影响 (n=6)

Contrast to model group，*P<0.05；**P<0.01;Contrast to normal group，▲P<0.05；▲▲P<0.01。

表2 女贞子对氧化应激水平的影响 (n=3)

Contrast to model group，*P<0.05；**P<0.01。Contrast to normal group，▲P<0.05；▲▲P<0.01。

4 讨论

PC12细胞来自于Rattus norvegicus(褐家鼠)肾上腺嗜铬细胞瘤(一种交感神经系统的肿瘤) ，经NGF诱导分化后，所合成的酶类、表达的受体以及合成的神经递质很接近中脑DA能神经元[4-5]。因此PC12细胞被广泛用作DA能神经元体外研究，特别是用于神经变性病如PD发病机制和药物作用机制的研究。MPTP对中脑黑质多巴胺神经元有选择性破坏作用[6]，MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶离子)是MPTP的活性代谢产物，是线粒体呼吸链复合物Ⅰ的抑制剂，可导致线粒体ATP 的缺失和膜电位的丧失，从而诱导PC12细胞线粒体功能障碍和氧自由基生成增加，造成多巴胺神经元损伤[7]。研究表明，氧化应激损伤导致一些氧化损伤标记物质明显增多，如MDA[8]。MDA和LDH含量增高，说明多巴胺能神经细胞损伤程度升高。SOD活性降低，导致自由基量增多。自由基另一个来源为大脑黑质病变，一氧化氮合成酶表达增加，从而导致一氧化氮(NO)和过氧硝酸盐自由基水平升高，进而导致多巴胺能神经细胞受损。

本实验采用将女贞子提取物、MPP+与PC12细胞共同培养的方法，考察不同提取物对PC12细胞的细胞活性及氧化应激作用的影响。实验结果表明女贞子水提物及70%醇提物均能显著性提高细胞存活率，且其作用与浓度有密切关系。另外，女贞子水提物能够显著降低SOD抑制率，减少MDA、NO及LDH含量，说明其具有抗氧化应激作用。由此推断，女贞子抗PD作用可能是通过抗氧化应激而实现的。

[1] 蒋雨平，王坚，丁正同，等.原发性帕金森病的诊断标准 (2005 年)[J]. 中国临床神经科学，2006，14(1)：40.

[2] P. Jenner. Oxidative stress in Parkinson's disease[J]. Annals of neurology， 2003，53(3)：26-S38.

[3] 张振明，蔡曦光，葛斌，等.女贞子多糖的抗氧化活性研究[J].中国药师， 2005，8(6)：489-491.

[4] 张广献 ，祝其锋. NGF 诱导 PC12 细胞分化的研究[J].生物学杂志，2002，19(4)：14-15.

[5] S LÜ，Y YANG，S LIU.An investigation on the division of neuronal PC12 cells induced by nerve growth factor[J]. Sheng li xue bao：[Acta physiologica Sinica]， 2005，57(5)：552-556.

[6] J W LANGSTON，P BALLARSD，J W TRTRUD，et al.Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis[J]. Science，1983，219(4587)：979-980.

[7] J LOTHARIUS，K LO'MALLEY.The Parkinsonism-inducing Drug 1-Methyl-4-phenylpyridinium Triggers Intracellular Dopamine Oxidation A NOVEL MECHANISM OF TOXICITY[J]. Journal of Biological Chemistry， 2000，275(49)：38581-38588.

[8] A R ESTEVES，D M ARDUNO，R H SWERDLOW，et al.Oxidative stress involvement in α-synuclein oligomerization in Parkinson's disease cybrids[J]. Antioxidants & redox signaling，2009，11(3)：439-448.

(责任编辑：姜付平)

Effect of Fructus Ligustri Lucidi on oxidative stress induced by MPP+in PC12 cells

Xu Xijuan，Yang Zhonglin*

(China Pharmaceutical University,State Key laboratory of Natural Products and Functions,Nanjing 210009,China)

Objective:To evaluate the effect of Fructus Ligustri Lucidi on oxidative stress in vitro. Methods:PC12 cells induced by MPP+was used as the vitro model of parkinson disease,while adding 70% ethanol extract and aqueous extract of Fructus Ligustri Lucidi of different concentrations. Cell vibility was determined by MTT methods.Effect of Fructus Ligustri Lucidi on oxidative stress was tested by kits of SOD,NO,MDA and LDH.Results:Contrast to normal group,cell viability of model group dropped significantly,and inhibition rate of SOD, content of MDA, content of NO and level of LDH of model group significantly raised.Compared with model group, aqueous extract of Fructus Ligustri Lucidi of 1mg/mL increased the cell vibility markedly,and lowered inhibition rate of SOD, content of MDA, content of NO and level of LDH significantly.Conclusion:It implys that aqueous extract of Fructus Ligustri Lucidi can protect PC12 cells from oxidative stress damage.

Fructus Ligustri Lucidi;PC12 Cells; MPP+;oxidative stress damage.

2014-03-11

徐希娟(1989-)，女，中国药科大学硕士研究生，研究方向为中药制剂学。

杨中林(1950-)，女，中国药科大学教授，博士生导师，研究方向为中药炮制与中药制剂。

R285

A

1673-2197(2014)11-0006-03