不同分级的慢性萎缩性胃炎患者Runx3基因甲基化状态及蛋白表达的研究

王 倍 赵春娜 张丽丽 郭 枫 肖丽丽 张春华

（黑龙江省大庆市大庆油田总医院，黑龙江 大庆 163411）

不同分级的慢性萎缩性胃炎患者Runx3基因甲基化状态及蛋白表达的研究

王 倍 赵春娜 张丽丽 郭 枫 肖丽丽 张春华

（黑龙江省大庆市大庆油田总医院，黑龙江 大庆 163411）

目的探讨不同分期慢性萎缩性胃炎（CAG）患者Runx3基因启动子甲基化状态，并分析与Runx3蛋白表达的相关性。方法搜集150例疑似CAG患者进行胃镜检查，取少许胃黏膜进行病理检查，依据病理结果将人群分为胃黏膜正常组、胃黏膜轻度、中度及重度改变4组人群，采用Sequenom公司的基质支持的激光释放/电离飞行时间质谱分析方法（MALDI-TOF MS）测定Runx3启动子甲基化状态；ELISA方法测定Runx3蛋白的表达。结果经病理检查胃黏膜正常组30例，胃黏膜轻度改变62例，中度改变23例，重度改变35例，CAG患者的Runx3基因启动子甲基化明显高于正常组（P＜0.05）；且在不同分级中的甲基化状态也不同（P＜0.05）；Runx3基因启动子甲基化与蛋白表达呈明显的负相关（P＜0.05）。结论Runx3基因甲基化状态与CAG的分期严重程度呈正相关，且会造成其蛋白表达量的降低。

慢性萎缩性胃炎；Runx3基因甲基化状态；蛋白表达

慢性萎缩性胃炎（CAG）是一种胃黏膜发生萎缩性改变的慢性胃炎，具体的发病机制尚不是非常的清楚，但随着幽门螺旋杆菌感染率的增高，环境污染物加重及不健康的生活方式如高脂、高盐饮食、蔬菜水果摄入不足等问题的凸显，使得我国CAG的患病率呈上升趋势，成为困扰数百万人的常见胃部疾病[1-3]。长期的CAG改变可导致机体胃癌发病率的增高，1978年世界卫生组织已将CAG列为胃癌的癌前状态，可见寻找早期CAG癌前病变对降低其胃癌的发病率有很大的帮助，从而达到早期预防及治疗的作用，是对临床工作的推动。

1 对象与方法

1.1 研究对象

大庆油田总医院消化科2013年6月至2013年10月150例疑似CAG患者，所有选取的研究对象均经过严格的纳入和排除标准进行筛选，纳入标准：所有患者均具有CAG相应的临床表现。排除标准为：近期有细菌或病毒感染，有心、肝、肾及血液系统相关疾病，经期或孕期妇女。所有研究对象均签署相应知情同意书。

1.2 生物样品的收集

对所有满足纳入和排除标准的150例研究对象进行胃镜检查并取相应组织做病理检查，结合病理分型，将150例研究对象分为胃黏膜正常组、胃黏膜轻度、中度及重度改变四组人群。采集所有研究对象外周静脉血2 mL，分装于两支EDTA抗凝管中，一份立即离心收集其血清用于Runx3蛋白含量的测定，另一份用于提取DNA，测定Runx3基因启动子甲基化的状况，在整个分析过程中采用严格的质量控制，所有生物样品均储存与-80 ℃低温冰箱中。

1.3 Runx3基因启动子甲基化测定

用天根DNA提取试剂盒提取外周静脉血中的DNA，经过定量、纯度检测后，采用sequenom公司的基因分析系统，用基质支持的激光释放/电离飞行时间质谱分析方法测定基因启动子的甲基化定量分析。先用亚硫酸氢钠进行修饰，由zymo公司提供，其他后续过程所需试剂和芯片均来自sequenom公司，CPG岛序列参照UCSC数据库，引物由sequenom相应设计软件Epidesigner设计，上海生物工程公司合成，结合相应的参考文献，正向序列为aggaagagag TTACGAGGGGCGGTCGTACGC，反向序列为cagtaatacgactcactataggg agaaggctAAAACGACCGACGCGAACGCCTCC。

1.4 Runx3蛋白表达情况

选用ELISA试剂盒测定Runx3蛋白含量，具体的实验步骤参照说明书进行，试剂盒购买于Abcom公司。

1.5 统计学处理

选用SPSS16.0进行数据的统计分析。定量数据用（x¯±s）表示，定性资料选择构成比表示，独立样本t检验、方差分析等研究调查对象之间年龄的差别，甲基化状态及蛋白表达量的差别，采用χ2检验分析两组研究对象吸烟、饮酒的差异，假设检验水准定为α=0.05。

2 结 果

2.1 研究对象的基本概况

根据病理学结果，将将150例研究对象分为胃黏膜正常组、胃黏膜轻度、中度及重度改变四组人群。对这4组人群的基本情况进行分析，包括年龄、吸烟及饮酒方面，结果无统计学差异，均衡可比。

2.2 4组人群中Runx3基因启动子CpG岛甲基化状态的分析

正常组甲基化率为（6.7±2.4）%，轻度改变组甲基化率为（10.0 ±8.8）%，中度改变组甲基化率为（18.3±9.3）%，重度改变组甲基化率（23.4±12.1）%。Runx3启动子CpG岛甲基化阳性表达率在CAG患者明显高于胃黏膜正常组（P＜0.05），且重度及中度胃黏膜改变组甲基化率明显高于正常组和轻度改变组（P＜0.05），但胃黏膜轻度改变组与正常组之间，中度改变组与重度改变组之间无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 4组人群中Runx3蛋白的表达

Runx3蛋白的浓度在CAG患者明显低于胃黏膜正常组（P＜0.05），且重度及中度胃黏膜改变组甲基化率明显低于正常组和轻度改变组（P＜0.05），但胃黏膜轻度改变组与正常组之间，中度改变组与重度改变组之间无显著性差异（P＞0.05），见表1。

表1 4组人群的Runx3蛋白表达的比较分析

3 讨 论

Runx3基因是Runx家族主要成员之一，是一种常见的抑癌基因。位于人的1号染色体上，该基因的转录受两种结构的启动子控制，内含大量的CPG岛的保守序列，这种CPG岛的甲基化的改变可导致转录过程受阻，可影响Runx3蛋白的分泌，而Runx3蛋白是TGF-β信号转导通路中的一个转录因子，参与细胞生长的负调控。Runx3蛋白缺失会导致TGF-β1引导的信号通路阻断，细胞对TGF-β1诱导的生长抑制作用和凋亡反应能力下降，最终影响到胃肠道上皮细胞的正常生长。目前国内外研究均已发现在多种消化道肿瘤特别是胃癌中均可能存在Runx3基因启动子甲基化的改变，而CAG作为一种癌前病变，可会存在Runx3基因甲基化的改变，本研究也已证实Runx3启动子CpG岛甲基化阳性表达率在CAG患者明显高于胃黏膜正常组（P＜0.05），且重度及中度胃黏膜改变组甲基化率明显高于正常组和轻度改变组（P＜0.05），但胃黏膜轻度改变组与正常组之间，中度改变组与重度改变组之间无显著性差异，可见随着胃黏膜损伤严重程度的增加，启动子甲基化水平明显的增高。

此外本研究也已发现随着胃黏膜损伤程度的增加会伴有Runx3蛋白分泌量的降低，特别是中度及重度胃黏膜改变的CAG患者，与甲基化程度呈明显的负相关。

总之，随着胃黏膜损伤的改变，Runx3基因启动子甲基化可明显的升高，且其甲基化的改变可能是蛋白表达缺失的主要原因，因此Runx3基因启动子甲基化可作为估计胃黏膜损伤程度的生物标志物，有助于胃黏膜损伤的早期诊断，从而尽早的选取合理的临床治疗方法，降低所致胃癌的发病率。

[1] 姜贻兴.慢性非萎缩性胃炎的饮食和环境因素分析[J].中国医药指南,2011,21(1):73-76.

[2] 康文全,赵成忠,张厚德,等.慢性非萎缩性胃炎与组织学、幽门螺杆菌、胃泌素和表皮生长因子相关性研究[J].胃肠病学和肝病学杂志,1999,2(1):102-105.

[3] 郑小梅,伍宁丰.DNA甲基化作用的生物学功能[J].中国农业科技导报,2009,11(1): 33-39.

R573.3+<2 文献标识码：B class="emphasis_bold">2 文献标识码：B 文章编号：1671-8194（2014）17-0131-022 文献标识码：B

1671-8194（2014）17-0131-02

B 文章编号：1671-8194（2014）17-0131-02