RNA酶T2在雄性小鼠生殖系统中的表达及对精子活动力的影响

薛 珂 凡 永 刘 悦 丁之德

上海交通大学医学院解剖学与组织胚胎学系（上海 200025）

·论 著·

RNA酶T2在雄性小鼠生殖系统中的表达及对精子活动力的影响

薛 珂 凡 永 刘 悦 丁之德*

上海交通大学医学院解剖学与组织胚胎学系（上海 200025）

目的检测核糖核酸酶T2（ribonuclease T2, RNaseT2）在雄性小鼠生殖系统和精子中的表达、定位及其对精子活动力及前向运动的影响。方法运用免疫荧光染色鉴定RNaseT2蛋白在小鼠生殖系统中的表达、定位及其与肌动蛋白（actin）在精子中的共定位关系，通过Real-time PCR检测RNaseT2 mRNA在小鼠生殖系统中的相对表达水平，借助计算机辅助精液分析（CASA）仪检测RNaseT2对小鼠精子的活动力、前向运动的影响。结果（1）RNaseT2蛋白及其mRNA在小鼠附睾头、体、尾组织以及输精管、前列腺及精囊腺分泌液中均有表达，而在睾丸组织中极低表达或未见表达。（2）在小鼠精子上，该蛋白定位于顶体、颈部、尾部鞭毛并与actin的表达定位具有一定的相似性。（3）体外纯化的RNaseT2蛋白可明显抑制小鼠精子的活动力及前向运动，且抑制具有时间及剂量依赖性。结论 在雄性生殖系统中，RNaseT2蛋白作为精子运动的调节因子对精子的活动力及前向运动具有明显的抑制作用。

核糖核酸酶T2; 雄性生殖系统; 精子活动力; 小鼠

近年来，男性不育症的发病率呈逐年上升趋势，对男性身心健康造成了严重的影响。男性不育症的病因主要包括性功能障碍和精液质量异常两个方面，其中后者根据精液分析结果可进一步划分为无精子症、少精子症、死精子症、弱精子症及少弱精症等。有研究表明，81.84%男性不育症患者存在精子运动不良，其中19%的患者精子仅在组织形态学上存在异常[1]，而在精子数量上无任何差异，表明精子运动功能下降是导致该病发生的重要因素。因此，寻找导致精子运动功能下调的关键分子，成为目前研究的热点，其研究结果对探索男性不育症的发病机制至关重要。

核糖核酸酶T2（ribonuclease T2，RNaseT2）是一类特殊的底物非特异性的核糖核酸内切酶，其广泛表达在原核细胞、真核细胞中，往往作为分泌蛋白被分泌到细胞间质中[2]。RNaseT2家族成员之一的ACTIBIND是一种由黑曲霉菌合成的蛋白。研究发现：当ACTIBIND与靶细胞内肌动蛋白（actin）结合后，可阻断细胞的生长及迁移[3,4]。我们曾在前期研究中报道人精子和精浆中均存在一定量的RNaseT2，其在人精子中的表达及定位与肌动蛋白有部分相似，尤其是在精子动力相关的尾部[5]，提示RNaseT2在精子成熟、获能、顶体反应等过程中可能发挥重要作用[6-9]。本研究将运用免疫荧光的方法分析RNaseT2蛋白在小鼠生殖系统中的表达、定位及其与肌动蛋白在精子中的共定位关系，并进一步从黑曲霉菌的培养液中分离纯化出较高纯度并且具有生物学活性的RNaseT2蛋白，体外将其与小鼠精子共孵育后，检测RNaseT2蛋白对小鼠精子活动力及前向运动的影响，为进一步探索男性不育症诊断与治疗的新方法奠定必要的理论基础。

材料与方法

一、实验动物

雄性ICR小鼠， 10～12周龄，购自上海交通大学医学院动物实验中心。

二、主要试剂与仪器

（一）试剂

Trizol（Invitrogen），逆转录酶（Takara），SYBR GreenPCR Master Mix（applied biosystems），正常兔IgG（Upstate），实验室自制兔抗RNase T2抗体，兔抗actin抗体（CST），FITC标记的羊抗兔IgG（Invitrogen），EMD-TMAE 层析填料（Merck），Mono Q层析填料（GE），Tyrode’s buffer（Sigma）。

（二）仪器

紫外/可见分光光度计（Nano Drop ND-1000 Spectrophotometer），PTC-200 PCR 仪（MJ Research），激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss LSM-510），计算机辅助精液分析仪（Hamhlton CX-41）。

三、方法

（一）小鼠精子的分离提取

采用颈椎脱臼法处死小鼠，分离取下附睾尾部后，置于含37℃预热的Tyrode’s buffer培养液中，稍剪碎组织并静置15min，待精子由附睾内游出后，吸取含有精子的Tyrode’s buffer上清液。

（二）RNaseT2在雄性小鼠生殖器官及与actin在精子中免疫共定位

将雄性小鼠颈椎脱臼处死后，剥离剪下睾丸、附睾头、附睾尾、输精管、前列腺、精囊腺等组织。将各个组织用OCT液包埋，冰冻切片机切成7μm 大小的切片并黏附于载玻片上。与此同时，将另一侧附睾内分离出的精子均匀涂于载玻片上，各载玻片上的组织或精子风干后，用预冷的4%多聚甲醛固定15min。PBS漂洗后 5%的牛血清白蛋白溶液封闭1h，再与实验室自制兔抗RNaseT2蛋白抗体（1:100）及兔抗actin抗体（1:100）4℃孵育过夜，并以同样浓度的正常兔IgG抗体作为阴性对照。次日，以FITC标记的羊抗兔IgG抗体（1:500）37℃孵育1h，PBS漂洗3次后封片，随后在激光共聚焦显微镜下进行荧光定位观察。

（三）实时荧光定量PCR （Real-time PCR）

采用Trizol法分别提取睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾、输精管、前列腺和精囊腺组织的总RNA，并通过RT Master Mix试剂盒反转录成cDNA。RNase T2引物设计采用PRIMER 5.0软件设计引物上游引物5' TCAAGCCATCCATCAACT 3'，下游引物5' TTCCGCAAATGTAAGTCC 3'，检测系统为Applieed Biosystems Real-Time PCR，反应条件如下：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s循环40次。通过测定Ct值表示目的基因mRNA表达量，基因表达的相对变化用2-△△Ct法分析表示。

（四）RNase T2蛋白的分离纯化

将黑曲霉菌培养液经针头过滤器过滤后，在pH值为6，浓度为2 mmol/L的乙酸钠溶液中透析72h，经蛋白亲和层析、阴离子交换层析及超滤浓缩后获得RNaseT2蛋白，并经SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定为纯化RNaseT2蛋白[20]。

（五）检测RNaseT2对精子活动力的影响

筛选出精子活动力较好且制备浓度在15～25×106个/mL的精子悬液，平均分为3份，分别加入RNaseT2溶液、RNaseA溶液及Tyrode’s培养液进行培养，并定义为实验组、对照组及空白组。根据不同的RNaseT2浓度和时间点运用计算机辅助精液分析仪检测各组精子活动力和前向运动。

（六）统计学分析

采用SPSS 11.0统计软件（Chicago，IL）进行数据处理，应用单因素方差分析对每组数据进行统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、RNaseT2蛋白在雄性小鼠生殖系统中的表达及定位

间接免疫荧光染色结果显示：在雄性小鼠生殖系统中，RNaseT2蛋白在睾丸组织中未见阳性表达而在附睾头部检测出较高荧光强度，之后在附睾尾部、输精管管腔内、前列腺及精囊腺组织的腺腔中均检测到荧光，提示RNaseT2在附睾头部、附睾尾部、输精管管腔液、前列腺及精囊腺组织及其分泌液中均有表达。

二、RNaseT2与actin在小鼠精子中的免疫荧光共定位

间接免疫荧光染色结果显示：在小鼠精子中，RNaseT2蛋白主要分布在精子顶体区域、颈部及尾部，其定位与精子中actin蛋白的定位有部分相似，尤其是在精子动力相关的尾部（图1）。

三、RNaseT2 mRNA在小鼠生殖系统中的相对表达水平

Real-time PCR结果显示：在小鼠生殖系统中，RNaseT2 mRNA在睾丸组织中表达水平极低，在附睾头处呈现第一个表达高峰，到附睾体时开始下降，一直维持至精囊腺，随后在前列腺处又出现第二个表达高峰。表明RNaseT2 mRNA水平在附睾头部及前列腺组织中较高（图2）。

图1 RNaseT2与actin蛋白在小鼠精子中的免疫荧光定位

图2 RNaseT2 mRNA在小鼠生殖系统中的相对表达水平

四、RNaseT2蛋白对小鼠精子活动力及前向运动的影响

将不同浓度（5μg/mL、10μg/mL、25μg/ mL、50μg/mL、100μg/mL）的RNaseT2蛋白溶液，分别与小鼠精子悬液培养15min后，通过计算机辅助精液分析（CASA）仪检测小鼠精子的活动力及前向运动。结果显示，与空白组及对照组（RNaseA组）相比，RNaseT2蛋白溶液可以明显抑制小鼠精子活动力及前向运动，且该作用具有明显的剂量依赖性。当RNaseT2蛋白溶液浓度为5μg/mL时即产生明显抑制效应，至100μg/mL时，效果最为明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图3 A，B）。

与此同时，为进一步探讨RNaseT2蛋白对小鼠精子活动力及前向运动的抑制作用是否具有时间依赖性，我们将浓度为5μ/mL的RNaseT2蛋白溶液与小鼠精子悬液培养后，分别于不同时间点检测精子的活动力和前向运动。结果发现共培养30min时的小鼠精子活动力和前向运动均要明显低于15min时的小鼠精子活动力（P＜0.05）及前向运动（P＜0.05），差异具有统计学意义（图3 C，D），表明随着作用时间的延长，RNaseT2对小鼠精子活动力及前向运动力的抑制效果逐渐增大。

图3 RNaseT2蛋白对小鼠精子活动力及前向运动的影响

讨 论

我们曾在前期研究中报道了人精子和精浆中均存在一定量的RNaseT2[5]，为明确RNaseT2是否也存在于小鼠的精子中及其在小鼠生殖过程中的作用。我们首先检测了RNaseT2蛋白在小鼠睾丸、附睾头、附睾尾、输精管、前列腺及精囊腺组织中表达情况。结果发现在小鼠生殖系统中，RNaseT2蛋白的表达起始于附睾头部，并且大量集中在附睾头上皮，并在附睾头、附睾尾、输精管、前列腺及精囊腺组织中均有阳性表达，而在睾丸组织中未见阳性信号。此外，Real-time PCR结果也显示与附睾等器官相比，RNaseT2 mRNA在睾丸组织中的相对表达水平也处于极低的状态，表明RNaseT2可能与睾丸中精子的发生无关，而附睾等器官中RNaseT2可能参与了精子成熟、顶体反应等过程。

研究发现，actin蛋白可定位在兔、公牛等哺乳动物精子的头部、颈部以及尾部区域[10,11]，在精子的活动力中发挥着关键的作用[6-9]，其解聚与重组可直接影响精子的形态学改变并通过精子尾部的超微结构影响其活动力[12-15]。因此，我们进一步通过免疫荧光的方法对RNaseT2蛋白与actin蛋白在小鼠精子中共定位进行了研究，结果发现小鼠精子中两者的定位具有部分的相似性。该结果与我们曾报道的人精子中RNaseT2蛋白与actin共定位表达的结论相一致[5]，表明RNaseT2蛋白与actin蛋白具有相互结合的空间基础，进一步支持RNaseT2可能参与了精子成熟、顶体反应的推论。

另一方面，肌动蛋白结合蛋白在精浆及精子中的表达分别与精子质量及精子成熟、顶体反应密切相关[16,17]。而本身作为一种肌动蛋白结合蛋白的RNaseT2也具有明显的抑制肿瘤细胞增殖与迁移的能力[18]，其机制是RNaseT2家族成员ACTIBIND可以通过与血管生成素竞争性结合细胞内肌动蛋白，从而引起肿瘤细胞（比如黑色素瘤）内肌动蛋白网络结构破坏、血管生成受到抑制，最后导致肿瘤细胞生长、活动及迁徙的停滞[3,4]。这说明RNaseT2并非通过其RNase酶的活性抑制细胞的活动，而是通过与肌动蛋白结合间接产生作用[19]。

为了进一步明确RNaseT2对精子活动力及迁移能力是否同样具有抑制作用，我们从黑曲霉菌的培养液中分离纯化出较高纯度并且具有生物学活性的RNaseT2蛋白，将其与小鼠精子共孵育后，并以相同浓度的RNAseA作为对照组，经检测后统计，发现RNaseT2蛋白在体外能明显抑制小鼠精子的活动力及前向运动力，并且该抑制作用呈时间依赖性和剂量依赖性，表明作为精子运动的调节因子之一，RNaseT2蛋白对小鼠精子活动具有明显的抑制作用。因此，通过本研究可为今后系统研究RNaseT2生物学功能及其对精子活动力调节作用的分子机制奠定必要的理论基础并提供可靠的实验依据。

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（2014-04-18收稿）

The expression and localization of RNase T2 in male mouse reproductive system and its effects on sperm motility

Xue Ke, Fan Yong, Liu Yue, Ding Zhide*Department of Anatomy, Histology and Embryology School of Medicine,Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025,China

Ding Zhide, E-mail: zding@shsmu.edu.cn

Objective To analyze the expression and distribution of RNase T2 in male mouse reproductive system and explore its effects on sperm motility.MethodsThe expression and localization of RNase T2 in the male mouse reproductive system and its co-localization with actin on mature spermatozoa were detected by indirect immunof uorescence analysis. The expression of RNase T2 in male mouse reproductive system was measured by real-time PCR. The effect of RNase T2 on mouse sperm motility and progressive motility were analyzed by a computer assisted semen analyzer (CASA).Results1. RNase T2 was expressed in mouse epididymal caput, corpus, and cauda, and secretions of vas deferens, prostate and seminal vesicle, however no Rnase T2 was found in mouse testis. 2. RNase T2 was co-localized with actin on the sperm head, neck and the tail regions. 3. RNase T2 had an inhibitory effect on the sperm motility and progressive motility in a dosedependent and time-dependent manners.ConclusionAs a regulator for sperm motility, RNase T2 in male reproductive system has a def nitely inhibitory effect on the motility and progressive motility of mouse spermatozoa.

ribonuclease T2 (RNase T2); male reproductive system; sperm motility; mouse

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.001

R 331.55; R 39

*通讯作者, E-mail: zding@shsmu.edu.cn