丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂对人精子活动力的影响

丁玉芹，姜 宏，汪存利

(安徽医科大学解放军临床学院生殖医学中心，安徽合肥 230031)

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)属于丝/苏氨酸蛋白激酶，有报道［1］其家族成员细胞外信号调节激酶(extracellularsignal regulated protein kinase，ERK)和p38MAPK定位于精子尾部中段，参与精子活动力的调节;17-β雌二醇可通过PI3K/Akt通路激活ERK，增加精子活动力，并且ERK是在精子由静止状态转变为运动过程中逐渐被活化的，抑制内源性ERK可以使精子鞭毛活力下降［2-3］。从理论上讲，增加或降低ERK和p38的活性可调节精子活动力。鉴于此，我们以ERK和p38信号转导通路特异性抑制剂PD98059和SB203580作用于精子细胞，旨在探讨PD98059和SB203580对精子ERK和p38MAPK及精子活动力的调节作用，为弱精子症的发病机制和临床治疗途径作一探索。

1 资料与方法

1.1研究对象研究对象来自于解放军105医院生殖医学中心门诊的男性不育患者，按照世界卫生组织精液分析标准(1999)，分别收集正常对照组和弱精子症组标本各15份。每份标本均经两次以上检查核实，且巴氏染色后精子正常形态率均＞15%。为避免其它细胞(生精细胞、白细胞和上皮细胞)的污染，按文献方法［4］，收集精子，PBS调整精子密度至50 ×106/ml，备用。

1.2PD98059和SB203580对精子活动力的影响

1.2.1浓度对精子活力的影响 将正常对照组和弱精症组样本按每孔100 μl分别接种于96孔细胞培养板中，分为空白对照组、不同浓度PD98059组和不同浓度SB203580组，每组均设3个复孔取其平均值。在37℃、5%CO2培养箱内温育1 h后，Malker精子计数板检测各组精子活动力。

1.2.2 作用时间对精子活力的影响将正常组和弱精症组精液样本按每孔100 μl接种于96孔细胞培养板中，分别加入浓度实验中对精子活动力影响最佳浓度的PD98059，分为空白对照组、80 μmol·L-1PD98059 组和 60 μmol·L-1SB203580组，置 37℃、5%CO2培养箱内分别温育 10、20、40、60 min，观察PD98059和SB203580干预不同时间精子活动力的变化。每个时间点均设3个复孔取其平均值，收集精子，储存于-196℃液氮中备用。

1.3ERK和p38磷酸化和蛋白表达水平测定取出精子沉淀，用Wsetern blot检测技术检测ERK和p38磷酸化和蛋白表达水平，Quantity One分析软件分析条带灰度值。

1.4统计学方法应用SPSS 11.5统计软件，各组间的差异性比较采用两组独立样本的t检验。

2 结果

2.1不同浓度的PD98059和SB203580对精子活动力的影响正常精子活动力随PD98059浓度的增加逐渐下降，80 μmol·L-1的PD98059对精子活动力的抑制程度最大;加入SB203580后弱精症患者精子活动力逐渐增加，浓度60 μmol·L-1时精子活动力升高最为明显。

2.2PD98059和SB203580作用时间对精子活动力的影响随着PD98059作用时间的延长，精子活动力逐渐下降，作用40 min精子活动力最低;而SB203580作用10 min后，精子活动力明显上升，随着作用的时间延长精子活动力呈下降趋势。

2.3PD98059和SB203580作用后精子PERK和pp38变化80 μmol·L-1PD98059作用于正常精子40 min后，总ERK表达水平无明显变化，但PERK/ERK比值明显下降，两组比较差别有统计学意义(P＜0.05)。60 μmol·L-1SB203580作于弱精子组精子10 min后总p38表达水平无明显变化，但pp38/p38比值明显下降(P＜0.05)。

3 讨论

PD98059是Ras-MAPK通路蛋白激酶MEK(MAPKK)的特异性抑制剂，可特异性地抑制MAPK的磷酸化而阻断细胞信号转导［5］。SB203580则作用于 p38与 ATP的结合位点Thr106，可使p38丧失与ATP的结合能力，从而使其失去激酶活性。本研究中，我们将不同浓度的 PD98059和SB203580分别作用于正常精子和弱精症患者精子，发现正常精子随PD98059作用时间的延长活力逐渐下降，而弱精子症患者精子则在SB203580作用短时间内活力升高，表明MAPK信号转导通路在调节精子活动力中起重要作用。免疫印迹技术检测也证实在PD98059干预后，伴随着精子活力的降低，ERK的磷酸化水平明显受抑制，活性下降;而SB203580干预后，随精子活力的提高，p38的磷酸化水平明显受抑制，活性亦下降，进一步证实PD98059和SB203580可通过MAPK信号转导通路调节精子活动力。

我们在实验中也观察到，PD98059和SB203580对精子活动力的调节在短时期内呈现浓度依赖性，但是PD98059和SB203580并不能完全抑制MAPK的活性，这可能与精子细胞内存在一个复杂的信号转导网络系统，除了MAPK通路外还存在其它信号转导通路有关。从信号转导通路入手可以更精确地探讨弱精症发病的分子机制，并为研发治疗弱精症的新药物提供一定理论和实验依据。

［1］Almog T，Lazar S，Reiss N，et al.Identification of extracellular signal regulated kinase1/2 and p38MAPK as regulators of human sperm motility and acrosome reaction and as predictors of poor spermatozoa quality［J］.J Biol Chem，2008，283(21):14479-89.

［2］Aquila S，Sisci D，Gentile M，et al.Estrogen receptor(ER)alpha and ER beta are both expressed in human ejaculated spermatozoa:evidence of their direct interaction with phosphatidylinositol-3-OH kinase/Akt pathway［J］.J Clin Endocrinol Metab，2004，89(3):1443-51.

［3］Lu Q，Sun Q Y，Breitbart H，Chen D Y.Expression and phosphorylation of mitogen-activated protein kinases during spermatogenesis and epididymal sperm maturation in mice［J］.Arch Androl，1999，43(1):55-66.

［4］Ostermeier G C，Dix D J，Miller D，et al.Spermatozoal RNA profiles of normal fertile men［J］.Lancet，2002，360(9335):772-7.

［5］Wu J，Wong W W，Khosravi F，et al.Blocking the Raf/MEK/ERK pathway sensitizes acute myelogenous leukemia cells to lovastatininduced apoptosis［J］.Cancer Res，2004，64(18):6461-8.