雷公藤活性成分对大鼠体内P450酶活性的影响

刘史佳，刘子修，周 玲，居文政，张 军，谈恒山

(南京中医药大学1.附属医院临床药理科、2.药学院，江苏 南京 210029;3.南京军区总医院，江苏南京 210002)

雷公藤(Tripterygium wilfordiiHook.)为卫矛科植物雷公藤的根、叶及花。其味辛苦，药性温凉，入肝、脾二经、通十二经络，其皮有毒，药用其蕊。雷公藤具有清热解毒、祛风通络、舒筋活血、消肿止痛、杀虫止血等功效。雷公藤在临床上效果明显，但是大量研究表明其临床上的毒副作用不容小视，由于其治疗窗较窄，低浓度时起到治疗作用，体内浓度较高时会引起毒副作用。如何在不影响其疗效的基础上降低或者消除其毒性，一直是研究人员广为关注的重要问题［1］。

有关中药安全性的问题报道日益增多，药物诱导或抑制CYP450导致的药物间的相互作用已经引起了医药界的关注。“Cocktail”探针药物法因其强大的分析能力和广泛的适用性而被成功的应用。它是鉴定药物间是否存在着相互作用的有效的方法［2］。

已有国外文献报道［3］，在体外试验表明雷公藤内酯醇在人体和大鼠肝微粒体中的代谢与CYP3A4和CYP2C19酶有关，其中CYP3A4是其主要的羟基化代谢酶。因此从药物代谢的角度出发，采用液质联用仪同时测定咪达唑仑和奥美拉唑在大鼠体内的浓度［4-6］，通过“Cocktail”探针药物包括咪达唑仑(midazolam)CYP3A4、奥美拉唑(chlorzoxazone)CYP2C19这2种探针药物的代谢变化进一步确证在大鼠体内雷公藤片对P450酶活性的影响，对于那些有多重代谢途径的药物的剂量设计有极为重要的指导意义。降低和避免在临床应用联合用药时由于药物相互作用而产生的毒副作用。

1 材料与方法

1.1药品与试剂雷公藤片(三九黄石制药厂，批号:090604，规格:100 mg/片，每片含雷公藤甲素33 μg)，注射用奥美拉唑钠(常州四药制药有限公司，批号:20100414D1，规格:40 mg/支)，咪达唑仑注射液(江苏恩华药业股份有限公司，批号:20100110，规格:1ml:5mg)，奥美拉唑对照品(中国药品生物制品检定所，批号:100367-200702)，咪达唑仑对照品(中国药品生物制品检定所，批号:171250-200401)，替硝唑对照品(中国药品生物制品检定所，批号:100338-200502)，甲醇、乙腈为色谱纯(Merck Company)，实验用水为超纯水。

1.2仪器Waters Quattro Micro液质联用仪(美国Waters公司)，色谱工作站:Masslynx 4.1;Labconco离心浓缩仪(美国照生公司);梅特勒 -托利多AE240电子天平(上海梅特勒-托利多有限公司);Biofuge PrimoR冷冻高速离心机(德国Heraeus公司);Millipore Drict-Q5超纯水机(法国Millipore公司);WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)。

1.3动物及给药方法SD♂大鼠，体质量(260±30)g，由南京中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXX(沪)2009-0008。动物随机分为低剂量和高剂量两组，每组8只。给药剂量为:低剂量组40 mg·kg-1，高剂量组80 mg·kg-1。将雷公藤片研磨成粉末，加少量纤维素钠制成混悬液灌胃，两组大鼠每天早晚灌胃雷公藤混悬液2次，连续给药10 d。在给雷公藤混悬液前，两组大鼠均给予Cocktail探针药物咪达唑仑、奥美拉唑，分别按30、50 mg·kg-1的剂量。在两组大鼠连续灌胃雷公藤混悬液10 d后，于次日早晨再次进行探针药物给药，两组大鼠的给药剂量，取血时间均和给雷公藤混悬液前相同。

1.4血样采集与处理在给大鼠探针药物前及给药后的 5，10，20，30，45，60，90，120，150，180，240 和360 min由眼眶静脉取血约0.4 ml。置肝素抗凝试管，离心，分离血浆存于-75℃待测。精密取血浆样品 100 μl，加入内标溶液(5 000 μg·L-1替硝唑甲醇溶液)10 μl，旋涡 30 s 混匀，加入 800 μl乙酸乙酯，旋涡 3 min，于 4℃ 12 000 r·min-1离心10 min，吸取上层溶液700 μl，放置于离心浓缩仪45℃至干，用 100 μl体积分数为 0.7 的甲醇溶解，10 μl进样分析。

1.5色谱条件色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm)(美国 Agilent公司);保护柱:Agilent Zorbax SB-C18(12.5 mm × 4.6 mm，5 μm)(美国Agilent公司);流动相为体积分数为0.001的甲酸(A液)∶甲醇(B液)=25∶75，流速:0.2 ml·min-1;柱温:30℃。

1.6质谱检测条件离子化方式为电喷雾(ESI);多反应监测(MRM);检测离子为正离子。咪达唑仑为［M+H］+，m/z=326.2→291.2;奥美拉唑为［M+H］+，m/z=364.2→136.1;替硝唑为［M+H］+，m/z=248.2→121.0。检测电压:3.5 kV;锥孔电压:50 V;离子源温度:110℃;脱溶剂温度:350℃;脱溶剂气体流速:450 L·h-1;碰撞气能量:20 EV［5］。

1.7血浆标准曲线的制备取空白血浆100 μl，加入内标液(5 000 μg·L-1替硝唑对照品)10 μl，再加入2种探针药物，使血浆中咪达唑仑、奥美拉唑的浓度分别为 1、5、10、50、100、500、1 000、5 000、1 ×104μg·L-1，按血浆样品处理方法处理。

1.8数据处理运用药动学专用软件DAS 2.0计算药动学参数。给药前后药动学参数的差异用SPSS 11.5统计，显著性检验采用两阶段交叉设计资料的方差分析。

2 结果

2.1色谱行为本色谱条件下，咪达唑仑保留时间在3.3 min左右，奥美拉唑保留时间在2.9 min左右，替硝唑(内标)保留时间在2.2 min左右。2种探针药物与内标分离良好，无杂峰干扰测定，基线平稳(见Fig 1)。本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的咪达唑仑、奥美拉唑的浓度，重现性好。

2.2标准曲线根据血浆标准曲线所测结果，将探针药物和内标的峰面积比值对探针药物的量浓度进行线性回归，得回归方程，咪达唑仑:^Y=0.03934X+0.01493，r=0.9987;奥美拉唑:^Y=0.01165X-0.00464，r=0.9991。

Fig 1 Chromatograms of the assay

2.3精密度与提取回收率考察日内精密度与日间精密度。按标准曲线配制方法制备含咪达唑仑和奥美拉唑的低、中、高 3 种(2、800、8 000 μg·L-1)浓度的含药血浆，每种浓度作5份样品，记录峰高比值(f)。根据随行标准曲线求得精密度，结果表明日内精密度与日间精密度均小于12%。同时测得探针药物的提取回收率分别为:咪达唑仑(83.1±6.2)%，奥美拉唑(80.9±5.6)%。

2.4样品稳定性考察本实验同时考察了2种探针药物在不同保存条件下的稳定性，发现咪达唑仑和奥美拉唑的血浆样品在-20℃冰箱内冷冻保存，7 d内样品稳定。标准品在甲醇中4℃下，可保存两个月以上，血浆样品在室温下24 h内稳定。血浆样品反复冻融2次后测定结果稳定。

2.5药动学参数

2.5.12种探针药物的药-时曲线 大鼠灌胃雷公藤片前、后灌胃Cocktail探针药物，按“1.6”项方法操作，测得2种探针药物的血药浓度，结果见Fig 2。

Fig 2 Pharmacokinetic profile of probe drugs in plasma

2.5.22种探针药物药动学参数 咪达唑仑、奥美拉唑药代动力学数据经中国药理学会推荐的DAS 2.0程序处理，分别按单室、二室、三室模型以最小二乘法拟合后，咪达唑仑、奥美拉唑符合二室模型，权重为1/C/C。2种探针药的生物半衰期)、表观分布容积(Vd/F)、机体总清除率(CL/F)、药时曲线下面积(AUC)、达峰时间(Tmax)、最大血药浓度(Cmax)，低剂量组见Tab 2;高剂量组见Tab 3。

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of two probe drugs after low dosing of Tripterygium wilfordii tablets in rats(n=8)

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of tow probe drugs after high dosing of Tripterygium wilfordii tablets in rats(n=8)

3 讨论

连续灌胃雷公藤片10 d后，低剂量组和高剂量组中咪达唑仑的AUC明显增加，CL/F明显降低，增大，Vd/F和Tmax变化不明显，高剂量组中Cmax有所增大;低剂量组中奥美拉唑的和Vd/F有所增大，高剂量组中AUC增加。试验结果表明，合并用药10 d后咪达唑仑在大鼠体内浓度增高，代谢减慢，说明雷公藤片对大鼠体内CYP3A4酶具有抑制作用;而CYP2C19酶在体内存在较大的多态性，代谢个体差异较大［6］，本实验所得的奥美拉唑的药代参数结果偏差较大，因此我们推测雷公藤片可能对大鼠体内的CYP2C19具有一定的抑制作用。根据本试验结果，当雷公藤片与CYP3A4、CYP2C19酶的底物药物合用时，需要调整给药剂量避免药物相互作用使体内血药浓度过高产生毒副作用。

近年来，Cocktail探针药物法已用于中药的临床相互作用研究，已有文献报道齐墩果酸［7］、胡黄连苷［8］中药成分抑制CYP酶活性，以及用Cocktail探针药物法评价连翘［9］对细胞色素P450的影响。雷公藤片的主要成分为雷公藤内酯醇和雷公藤红素，成分较复杂，有效物质不明确，给药代动力学研究带来困难。根据中药多成分和多靶点的特点，Cocktail探针药物法开辟了中药研究新的思路，为今后的中药药理药效的研究提供了酶学基础上的理解和依据。为联合用药时给药方案的制定提供理论依据。

雷公藤片在临床应用广泛，具有一定的毒副作用，中西药合用较多，可能存在潜在的药物相互作用。有文献研究表明，体外肝微粒内雷公藤内酯醇的代谢与CYP3A4和CYP2C19酶有关［4］。本试验采用“Cocktail”探针药物法进一步验证了雷公藤制剂对大鼠体内这两种亚型的酶有抑制作用。在临床合并用药时需要调整给药剂量避免药物相互作用使体内血药浓度过高产生毒副作用，从而为临床安全用药提供科学的依据。

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