扶肾降浊方对肾小管间质损害大鼠抗纤维化因子HGF、BMP-7的影响*

李春雨，魏晓露，苏玮莲，李国霞

（天津医科大学国际医学院，天津 300070）

扶肾降浊方对肾小管间质损害大鼠抗纤维化因子HGF、BMP-7的影响*

李春雨，魏晓露，苏玮莲，李国霞

（天津医科大学国际医学院，天津 300070）

[目的]探讨扶肾降浊方对系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）大鼠肾小管间质损害的疗效机制。[方法]在MsPGN动物模型基础上，延长造模时间至20周，使其自然发展为肾小管间质损害模型。实验设中药组、西药组、模型组及空白组。中药组给予扶肾降浊方，西药组给予贝那普利，模型组和空白组给予生理盐水，连续20周，分别于实验第12、16和20周末取材，采用实时逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组织化学法检测大鼠肾组织抗纤维化因子肝细胞生长因子（HGF）、骨形态发生蛋白-7（BMP-7）mRNA及蛋白表达水平。[结果]模型大鼠肾组织HGF、BMP-7 mRNA和蛋白表达下调，扶肾降浊方随着给药周期的延长可部分逆转间质损害造成的上述mRNA和蛋白表达异常。[结论]扶肾降浊方对MsPGN大鼠肾小管间质损害保护作用机制可能与调节抗纤维化因子HGF、BMP-7 mRNA和蛋白表达有关。

扶肾降浊方；肾小管间质损害；肝细胞生长因子；骨形态发生蛋白-7

慢性肾功能衰竭是危害人民健康和生命的常见病，在自然人群中的年发病率为（98~198）/100万，发达国家发病率更高[1]。现代研究表明，肾小管间质损害是导致慢性肾功能衰竭的重要原因[2]。肾小管间质损害是肾小球肾炎由炎症启动进展至肾小球硬化的中间环节，肾小球肾炎进展至肾小球硬化，大多已不可逆转，而对其中间环节即肾小管间质损害进行早期有效干预则可极大延缓肾小球肾炎进展，对防治慢性肾脏疾病具有重要意义[3-6]。扶肾降浊方在临床广泛用于慢性肾脏疾病的治疗，多年的临床实践取得了总有效率为82.5%的疗效[7]。动物实验表明，扶肾降浊方能改善慢性肾功能衰竭大鼠的常规生化指标，延缓肾功能衰竭的病理进程[8]。但对肾小管间质损害的保护作用机制尚不十分清楚。本研究基于抗纤维化因子肝细胞生长因子（HGF）、骨形态发生蛋白-7（BMP-7）对肾小管间质损害的调控作用，探讨扶肾降浊方对系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）肾小管间质损害的保护作用机制。

1 材料

1.1药物与试剂 扶肾降浊方组成：山茱萸12 g，生黄芪30g，白花蛇舌草30g，丹参30g，鬼箭羽30g，益母草30g，实验所用中药制剂为天津中医药大学中药学院按既定工艺制备的配方颗粒，每克含生药4.06g，批号20120810；盐酸贝那普利片，北京诺华制药有限公司，批号X1801；葡萄球菌肠毒素B（SEB），军事医学科学院微生物流行病研究所提供；完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂，美国Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA），美国Amresco公司；TRNzol Reagent、反转录试剂盒、实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RTPCR）试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；兔抗大鼠BMP-7抗体，英国Abcam公司；兔抗大鼠HGF抗体，英国Abcam公司；过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒，北京尚柏生物医学技术有限公司。

1.2 动物 雄性Wistar大鼠72只，体质量（150±10）g，由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所提供，合格证号：SCXK（军）2009-003。

1.3 仪器 ABI 7500型实时荧光定量基因扩增仪，美国应用生物系统公司产品；LEICA组织处理系统（ASP200脱水机、EG1150包埋机、RM2245切片机），德国徕卡公司产品；奥林巴斯BX51显微镜成像系统，日本奥林巴斯公司产品。

2 方法

2.1模型制备与分组 将雄性Wistar大鼠72只，按随机数字表法随机分为4组：中药组、西药组、模型组和正常组，每组18只。造模方法参考相关文献[9-10]，并加以改进：于实验第1天隔日灌胃，给予10 g/L BSA水溶液，共20周，空白组给予等体积生理盐水。第1天除正常组外各组每只大鼠分点注射完全弗氏佐剂0．2 mL，第8天注射不完全弗氏佐剂0．2 mL，第8、15天尾静脉注射SEB 0．4 mg/kg，空白组注射等体积生理盐水。自造模第1天，中药组以扶肾降浊方生药51．5g/kg灌服，西药组以贝那普利4mg/kg灌服，正常组和模型组灌服等体积生理盐水，共20周。第12、16、20周末每组随机选取6只大鼠剖取肾组织用于各项指标的检测。

2.2检测指标

2.2.1实时RT-PCR Trizol法提取总RNA，按照试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。以反转录产物为模板，引物序列见表1，进行实时RT-PCR反应。反应体系为20 μL：2×Super Real PreMix Plus 10 μL，正反向引物（10μmol/L）各0．6μL，模板（反转录产物）1 μL，50×ROX Reference Dye 0．4 μL，ddH2O 7．4 μL。反应条件：95℃预变性15 min；95℃变性10 s；50～60℃退火/延伸30 s；循环40次。反应结束后自动生成溶解曲线，结果以Ct值表示，采用2-△△Ct法对目的基因进行相对定量分析[11]。

表1 基因引物序列及片段Tab.1 Primer sequences and fragments

2.2.2免疫组织化学法 取部分肾组织脱水、石蜡包埋、3 μm厚切片，常规脱蜡、水化。加一抗兔抗大鼠HGF（1∶80）、BMP-7（1∶75），4℃过夜，加生物素化山羊抗兔IgG，37℃45 min，DAB显色，苏木素复染、封片镜检，在低倍镜下（×200），每张切片随机选取5个肾小管间质区域视野，采用IPP 6．3专业图像分析软件进行分析，计算各区域单位面积HGF、BMP-7蛋白阳性细胞数，取其平均值为该标本HGF、BMP-7蛋白的相对含量[12]。

2.3统计分析 SPSS18．0软件进行统计学分析。计量资料均以均数±标准差（±s）表示。正态分布计量资料组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较时，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法；偏态分布计量资料比较采用秩和检验，P＜0．05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1扶肾降浊方对肾组织HGF、BMP-7mRNA表达的影响 MsPGN大鼠肾小管间质损害后，模型组与空白组比较，HGF、BMP-7 mRNA表达下调（P＜0．05）。随着造模周期的延长，扶肾降浊方和贝那普利在第12、16和20周均可明显上调肾组织HGF、BMP-7 mRNA表达（P＜0．05），无明显时间依懒性。结果见表2和表3。

表2 扶肾降浊方对肾组织HGF mRNA表达的影响（±s）Tab.2 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on mRNA expression of HGF in renal tissue（±s）

表2 扶肾降浊方对肾组织HGF mRNA表达的影响（±s）Tab.2 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on mRNA expression of HGF in renal tissue（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 剂量 n 给药12周 给药16周 给药20周空白组 - 6 0．64±0．27 0．44±0．29 0．26±0．17模型组 - 6 0．15±0．06* 0．02±0．01* 0．01±0．00*中药组 17．01 g/kgm 6 0．58±0．18*#0．33±0．11*#0．20±0．07#西药组 01．80 mg/kg 6 0．63±0．19#0．38±0．12*#0．24±0．18*#

表3 扶肾降浊方对肾组织BMP-7 mRNA表达的影响（±s）Tab.3 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on mRNA expression of BMP-7 in renal tissue（±s）

表3 扶肾降浊方对肾组织BMP-7 mRNA表达的影响（±s）Tab.3 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on mRNA expression of BMP-7 in renal tissue（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 剂量 n 给药12周 给药16周 给药20周空白组 - 6 0．32±0．41 0．44±0．13 0．28±0．13模型组 - 6 0．03±0．01* 0．04±0．03* 0．02±0．01*中药组 17．01 g/kg 6 0．30±0．18*#0．32±0．15*#0．27±0．15#西药组 1．8 mg/kg 6 0．28±0．19*#0．31±0．21*#0．25±0．10*#

3.2扶肾降浊方对肾组织HGF、BMP-7蛋白表达的影响 MsPGN大鼠肾小管间质损害后，模型组与空白组比较，HGF、BMP-7蛋白表达下调（P＜0．05）。随着造模周期的延长，扶肾降浊方和贝那普利在第12、16和20周均可明显上调肾组织HGF、BMP-7蛋白表达（P＜0．05），无明显时间依懒性。结果见表4和表5。

4 讨论

肾小球疾病引起肾小管间质损害，并最终导致肾小管间质纤维化的病理生理过程，主要经历4个阶段：第一阶段是细胞的活化和受损阶段；第二阶段是促纤维化因子的释放，同时一些抗纤维化的因子也被释放，如HGF、BMP-7等，可引起抗纤维化反应，参与肾脏的自身防御，促进炎症消散和组织修复，“攻击”和“防御”的平衡决定肾脏疾病的转归；第三阶段纤维化的形成；第四阶段是肾脏结构和功能受损。因此，第一和第二阶段是肾小管间质纤维化过程中的关键环节[13-15]。笔者前期研究发现，MsPGN大鼠发展为肾小管间质损害后，肾组织TGF-β1/ Smads/ILK信号转导通路发生改变，其中TGF-β1、Smad3、ILK基因表达上调，Smad7基因表达下调，扶肾降浊方可干预TGF-β1/Smads/ILK信号转导通路逆转肾小管损害造成的上述基因表达异常，进而负性调节肾小管上皮细胞间质转分化，减少炎细胞的浸润与减轻肾小管间质和肾小球损伤，延缓肾小管间质损害病程的进展[16]。本研究从肾小管间质纤维化过程的第二阶段着手，观察扶肾降浊方对肾小管间质损害大鼠抗纤维化因子HGF、BMP-7的影响，探讨扶肾降浊方对系膜增生性肾炎肾小管间质损害的保护作用及可能机制。

表4 扶肾降浊方对肾组织HGF蛋白表达的影响（±s）Tab.4 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on protein expression of HGF in renal tissue（±s）

表4 扶肾降浊方对肾组织HGF蛋白表达的影响（±s）Tab.4 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on protein expression of HGF in renal tissue（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 剂量 n 给药12周 给药16周 给药20周空白组 - 6 29．17±4．26 29．83±4．07 28．83±2．79模型组 - 6 17．17±3．60* 18．83±4．40* 17．17±2．79*中药组 17．01 g/kg 6 38．33±3．56*#39．17±3．49*#38．33±2．88*#西药组 1．8 mg/kg 6 29．50±2．43#29．17±2．04#29．33±3．01#

表5 扶肾降浊方对肾组织BMP-7蛋白表达的影响（±s）Tab.5 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on protein expression of BMP-7 in renal tissue（±s）

表5 扶肾降浊方对肾组织BMP-7蛋白表达的影响（±s）Tab.5 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on protein expression of BMP-7 in renal tissue（±s）

注：与空白组比较，*P＜0．05；与模型组比较，#P＜0．05。

组别 剂量 n 给药12周 给药16周 给药20周空白组 - 6 60．50±4．85 61．83±2．93 63．00±4．69模型组 - 6 12．33±3．27* 12．33±3．08* 11．83±4．54*#中药组 17．01 g/kg 6 29．67±5．16*#34．00±5．06*#36．33±2．42*#西药组 1．8 mg/kg6 39．50±3．39*#48．83±2．40*#48．50±3．08*#

HGF和BMP-7是重要的肾营养因子，负性调节肾纤维化[17]。HGF是一种对多种器官具有多效性的多肽细胞因子，在动物模型中能明显抑制患病肾脏系膜细胞及成纤维细胞的活化。可拮抗TGF-β1介导成纤维细胞激活，阻断小管细胞转化而发挥其保护肾脏阻止其纤维化作用，而HGF水平下降会加重肾纤维化程度。BMP-7是另一种重要的肾营养因子，广泛表达于各种肾脏细胞且对肾脏的发育起着决定性作用[18]。在肾脏发育过程中，BMP-7缺乏导致后肾间充质细胞死亡。BMP-7缺乏的小鼠在围产期死于尿毒症[19]。

根据中医理论，慢性肾小球肾炎发展到肾小管间质损害阶段，既有脏腑功能的虚损，又有湿热瘀浊等病理产物的蓄积。脾肾两虚（尤其是肾虚）是其发病的内在因素，湿热瘀浊是其迁延不愈的病理基础，为此，笔者建立了扶肾降浊法为治疗本病的基本大法，以此为指导配伍组成扶肾降浊方[20]。扶肾降浊方由山茱萸、敛精固涩，生黄芪、白花蛇舌草、丹参、鬼箭羽、益母草6味中药组成，山茱萸益肝肾之阴，敛精固涩生黄芪补肺脾之气，两药相伍，使滋阴不至于呆腻，补气不过于温燥，以扶肾固本；白花蛇舌草清热利湿解毒，丹参、鬼箭羽、益母草活血化瘀，利水消肿，清除体内湿热、瘀浊等病理产物，恢复机体的正常代谢功能，以治标。诸药合用，标本兼治，既有整体调节，又有对因治疗，从而达到控制疾病进展的目的。本研究发现，MsPGN大鼠发展为肾小管间质损害后抗纤维化因子HGF、BMP-7 mRNA和蛋白表达水平均明显下降，随着造模周期的延长，扶肾降浊方能部分逆转肾小管损害造成的上述mRNA和蛋白表达的异常，提示扶肾降浊方可通过改善抗纤维化因子HGF、BMP-7 mRNA和蛋白的低表达，可能是其发挥保护肾小管间质作用的机制，本研究为中医药防治慢性肾功能衰竭提供了新的思路。

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Effect of Fushen Jiangzhuo formula on anti-fibrosis factors of HGF and BMP-7 in rats with renal tubulointerstitial lesion

LI Chun-yu,WEI Xiao-lu,SU Wei-lian,LI Guo-xia
（International Medical School,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China）

[Objective]To study the protective effects and mechanism of Fushen Jiangzhuo formula(FSJZ)on renal tubulointerstitial lesion in rats.[Methods]The Mesangial proliferative glomerulonephritis(MsPGN)in rats was produced and through extending the time of the modeling to 20th weeks the model was naturally developed to tubulointerstitial lesion.The rats were divided into 4 groups,including Chinese medicine group,Western medicine positive control group,model group and blank group.FSJZ formula was given to the rats of Chinese medicine group and benazepril was given to Western medicine group,while the same volume of saline was given to the animals in model group and blank group for 20 weeks.We isolated the kidney tissue of the rats at the end of 12,16,20 week and observed the effect of FSJZ on anti fibrosis factors of HGF and BMP-7 in renal tissue by real-time reverse transcription-polymerase chain reaction and immunohistochemistry method.[Results]The anti-fibrosis factors of HGF and BMP-7 changed in renal tubulointerstitial lesion in rats.Renal tubulointerstitial lesion could significantly down-regulate the expressions of HGF and BMP-7,while FSJZ could significantly up-regulate the expressions of HGF and BMP-7 and antagonize these effects caused by renal tubulointerstitial lesion.[Conclusion]FSJZ has distinct effects of protecting pathological renal interstitial fibroblasts.The mechanism may be related with the regulating effect of FSJZ on mRNA and protein expression of HGF and BMP-7.

Fushen Jiangzhuo formula;renal tubulointerstitial lesion;hepatocyte growth factor;bone morphogenetic protein-7

R692.31

A

1672-1519（2014）12-0748-04

2014-08-20）

（本文编辑：马 英，于春泉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.12.14

天津市自然科学基金项目（No.11JCYBJC12800）。

李春雨（1985-），男，博士，讲师，主要从事中药药理学研究。

李国霞，E-mail:liguoxia96@163.com。