益气通络法对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经细胞凋亡和HO-1表达的影响

常 庚，孙大勇，常风云，孙晓培，韩 杰

（1.大连医科大学附属第一医院神经内科，大连 116011；2.河北医科大学中西结合学院，石家庄 050091）

益气通络法对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经细胞凋亡和HO-1表达的影响

常 庚1，孙大勇1，常风云2，孙晓培1，韩 杰1

（1.大连医科大学附属第一医院神经内科，大连 116011；2.河北医科大学中西结合学院，石家庄 050091）

[目的]观察益气通络法对糖尿病大鼠周围神经病变（DPN）的疗效，并探讨其作用机制。[方法]Wistar大鼠腹腔注射链脲佐菌素复制糖尿病模型，对成模大鼠每日用益气通络法灌胃，8周后检测坐骨神经细胞凋亡数目，乳酸脱氢酶（LDH）活性，促凋亡因子Bax、Caspase-3和血红素氧合酶-1（HO-1）的表达水平。[结果]与模型组比较，益气通络法明显减少糖尿病大鼠坐骨神经凋亡细胞数目，降低LDH含量、抑制Bax、Caspase-3的表达，增加HO-1蛋白的表达。[结论]益气通络法能有效上调HO-1的表达，降低坐骨神经细胞的凋亡，预防和治疗糖尿病周围神经损伤。

糖尿病周围神经病变；凋亡；坐骨神经

糖尿病周围神经病变是糖尿病最常见的并发症之一，其发生率高达60%～90%，以感觉神经受累最为常见，是糖尿病患者致残的主要原因，严重影响糖尿病患者的生存质量[1-3]。笔者采用经验方益气通络法治疗该病取得较好的疗效，本研究通过观察益气通络法对糖尿病大鼠坐骨神经细胞凋亡及二相酶血红素氧合酶-1（HO-1）蛋白的表达等，探究益气通络法治疗糖尿病周围神经病变的机制，为其在临床应用提供实验依制。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康清洁级Wistar雄性大鼠60只，体质量150～180 g，鼠龄4～6周，由河北省医学实验动物中心提供。

1.2药品及试剂 益气通络法组成：黄芪、桃仁、红花、怀牛膝、赤芍、威灵仙、当归等（购自乐仁堂药房，经河北医科大学中药系鉴定，符合国家药典标准），在河北医科大学中药系指导下常规水煎，醇提，浓缩至含生药3 g/mL备用。测定乳酶脱氢酶（LDH）的试剂购自南京建成生物工程研究所，HO-1蛋白一抗购自Cell Signal公司，链脲佐菌素购自美国Sigma公司，Caspase一抗购自北京博奥森生物技术有限公司，Bax购自Santa Cru公司；TNNUL细胞凋亡检测试剂盒购自罗氏公司。

1.3模型建立及给药 大鼠适应性喂养1周后，随机抽取20只为对照组，常规饲料喂养，自由进水。其余大鼠采用高糖高脂饲料喂养（标准饲料67.5%，猪油10%，蛋黄2.5%，蔗糖20%）喂养，4周后禁食12 h，一次性腹腔注射1%的链脲佐菌素（50 mg/kg，柠檬酸钠—柠檬酸缓冲液配制）造模，72 h后以空腹血糖≥16.7 mmol/L并伴有胰岛素抵抗者为造模成功，正常对照组腹腔注射等体积枸椽酸缓冲液。将成模大鼠再随机分为模型组19只、中药干预组19只。

中药干预组：每日给益气通络法中药25 g/kg（相当于成人计量的20倍）。正常对照组、模型组：每日给相同容积的生理盐水灌胃。中药干预共8周。

1.4标本采集 中药干预8周后禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛完全麻醉后，剖取坐骨神经，取部分组织固定于4%的甲醛溶液中。按常规固定、脱水，石蜡包埋，切片以供检测细胞凋亡、Bax、Caspase-3、HO-1等备用。其余坐骨神经组织制成匀浆，以供检测LDH活性。

1.5TNNUL法检测细胞凋亡率 应用TNNUL法检测坐骨神经细胞凋亡,操作步骤按说明书。

1.6Bax、Caspase-3表达的检测 4%多聚甲醛固定40 min，Triton X-100浸透10 min，10%马血清封闭60 min阻断非特异性染色,单克隆抗体Bax、Caspase-3摇床过夜，次日加生物素化马抗小鼠IgG 60 min，SABC 60 min，DAB显色3～10 min，脱水、透明、封固。

1.7LDH活性检测 采用比色法测定坐骨神经组织匀浆中的LDH活性，测试操作过程严格按照说明书进行。

1.8HO-1蛋白表达的检测 采用Western印迹方法测定。以每个样品的总蛋白为200 μg进行上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜至PVDF，脱脂奶粉封闭，一抗封闭4℃过夜，二抗37℃孵育1 h（羊抗兔），漂洗后用增强化学发光法检测蛋白表达，自动扫描，进行灰度分析。

1.9统计分析 采用Excel软件及SPSS 18.0统计软件进行统计分析。各组数据方差齐时，组间比较用方差分析；方差不齐时，采用秩和检验，数据用均数±标准差（±s）表示。以P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1坐骨神经细胞凋亡数目及坐骨神经组织中LDH含量 与正常对照组比较，模型组在坐骨神经细胞凋亡数目及坐骨神经组织中LDH含量均显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，中药干预组在坐骨神经细胞凋亡数目及坐骨神经组织中LDH含量均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 中药干预对坐骨神经组织中LDH及凋亡数目的影响（±s）

表1 中药干预对坐骨神经组织中LDH及凋亡数目的影响（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.01。

组别 LDH（U/mg） 凋亡数目（个）正常对照组 167.2±63.4 6.25±0.50模型组 445.5±91.7 37.38±6.00中药干预组 267.2±63.4* 19.34±3.75*

2.2凋亡因子Bax、Caspase-3表达的检测 与正常对照组相比，模型组Bax、Caspase-3的表达均显著增多，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，中药干预组Bax、Caspase-3表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图1、图2。

图1 Caspase-3在坐骨神经表达

图2 Bax在坐骨神经的表达

2.3坐骨神经HO-1蛋白的表达 检测中药干预对坐骨组织HO-1蛋白表达的影响，利用图片扫描仪分析结果显示：中药干预组的坐骨神经组织中HO-1蛋白的表达高于正常对照组和模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

图3 中药干预对坐骨神经组织中HO-1表达的影响

3 讨论

糖尿病属于中医“消渴”的范畴，糖尿病周围神经损伤属于糖尿病常见的慢性并发症。依据中医“久病入络”和“久病多虚”的理论，认为其病机主要由于消渴日久正气亏虚，不能行血，瘀阻络脉所导致[4-5]。益气通络法有益气养血，活血通络之功能。

坐骨神经细胞损伤和凋亡是糖尿病周围神经病变早期的病理、生理特征之一[5]。临床病理证实，糖尿病患者坐骨神经细胞凋亡数目显著增加，其典型的凋亡相关超微结构变化为核膜破裂以及形成凋亡小体等。本研究结果显示，中药干预组坐骨神经细胞凋亡数目及LDH活性显著下降。提示中药方剂益气通络法可显著改善周围神经病变（DNP）大鼠坐骨神经细胞凋亡，具有有效的神经细胞保护作用。

细胞凋亡具有复杂的分子调控机制病变[6]。目前认为Caspase-3、Bax是促进凋亡的重要因子[7]。Caspase-3被认为是Caspase级联反应中最关键的效应蛋白酶，是细胞凋亡过程中的终末剪切酶，该酶是否被激活也是鉴别细胞凋亡与坏死的主要依据；促凋亡蛋白Bax可改变线粒体膜的通透性，使线粒体膜间隙的细胞色素C（Cytochrome C）诱导细胞凋亡[8]。结果显示，给予中药方剂益气通络法干预后，坐骨神经细胞凋亡率及Bax和Caspase-3表达下降。提示益气通络法可以有效降低促凋亡蛋白Caspase-3及Bax的表达，抑制坐骨神经细胞的凋亡。

氧化应激密切参与了糖尿病周围神经病变的发生机制，在高血糖条件下，自由基生成增多是糖尿病临床并发症的首要原因[9-10]。组织中HO－1是哺乳动物组织细胞微粒体的一种蛋白酶，催化血红素产生胆绿素、一氧化碳（CO）和铁[11-12]。胆绿素再形成胆红素，两者是体内强有力的自由基清除剂。研究证实，氧化应激是导致细胞凋亡的重要机制，上调HO-1可以显著抑制氧化应激诱导的细胞凋亡。研究显示，益气通络法能明显上调抗氧化蛋白HO-1的表达。

综上所述，氧化应激和细胞凋亡在糖尿病周围神经病变中都起到了重要作用，并且两者是相互联系的。推测益气通络法治疗糖尿病周围神经病是通过上调抗氧化蛋白HO-1表达，抑制凋亡因子，以减轻坐骨神经细胞凋亡和损伤，延缓糖尿病周围神经病变的发生与发展。

[1]方朝晖，赵进东.从叶天士辛润通络法论治糖尿病周围神经病变[J].天津中医药，2013,30(7):410-411.

[2]冯天笑.活血通络法治疗糖尿病周围神经病变研究概况[J].天津中医药，2011，28（5）：438-440.

[3]张 玉，李云平.穴位注射治疗糖尿病周围神经病变研究进展[J].天津中医药，2011，28（4）：348-350.

[4] 高 岑，宋俊生，薛晓焕，等.当归四逆汤与西药治疗糖尿病周围神经病变疗效比较的系统评价[J].天津中医药大学学报，2011，30（3）：155-159.

[5]张 月，王 凡.活血降糖胶囊治疗糖尿病周围神经病变临床观察[J].天津中医药大学学报，2008，27（4）：278-279.

[6]李 超，伏圣博，刘华玲,等.细胞凋亡研究进展[J].世界科技研究进展，2007,29(3):45-53.

[7]岳原亦，张 扬，张一奇.Caspase家族与细胞凋亡[J].中国医疗前沿,2011,6(6):25-26.

[8]毛德文，陈月桥，王 丽，等.Caspase-8及Caspase-3与细胞凋亡[J].辽宁中医药大学学报，2008,10（10）：148-150.

[9] Wu YB,Shi LL,Wu YJ,et al.Protective effect of gliclazide on diabetic peripheral neuropathy through Drp-1 mediatedoxidative stress and apoptosis[J].Neurosci Lett,2012,523 (1):45-49.

[10]Kellogg AP,Cheng HT,Pop-Busui R.Cyclooxygenase-2 pathwayasapotentialtherapeutictargetindiabeticperipheral neuropathy[J].Curr Drug Targets,2008,9(1):68-76.

[11]Sima AA.Pathological mechanisms involved in diabetic neuropathy:can we slow the process[J].Curr Opin Investig Drugs,2006,7(4):324-337.

[12]lguero B,Gueron G,Giudice J,et al.Unveiling the association of STAT3 and HO-1 in prostate cancer:role beyond heme degradation[J].Neoplasia,2012,14(11):1043-1056.

Effects of Yiqi Tongluo formula on cell apoptosis and the expression of anti-Oxidant of HO-1 in sciatic nerve on diabetic peripheral neuropathy

CHANG Geng1,SUN Da-yong1,CHANG Feng-yun2,SUN Xiao-pei1,HAN Jie1
（1.Department of Neurology,First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China; 2.Hebei Medical University,Shijiazhuang 050091,China）

[Objective]To discuss the effects of Yiqi Tongluo formula on rats with diabetic peripheral neuropathy(DPN)and explore its potential mechanisms.[Methods]The rat model of DPN was induced by intraperitoneal injection of streptozotocinith,and DPN rats were divided into treatment group treated with daily Yiqi Tongluo formula for eight weeks.The expression of LDH,Bax,Caspase-3 and the number of cell apoptosis in the sciatic nerve were evaluated and compared.[Results]Compared with the model group,the number of apoptotic cells and the expression of LDH,Bax,Caspase-3 were lower in the Yiqi Tongluo group in rat sciatic nerve,while the expression of HO-1 is higher significantly.[Conclusion]Yiqi Tongluo formula can effectively increase the expression of HO-1,inhibit the oxidative damage and reduce cell apoptosis in sciatic nerve.

diabetic peripheral neuropathy;cell apoptosis;sciatic nerve

R285.5

：A

：1673－9043（2014）04－0216-03

2014-03-05）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.04.08

常 庚（1981-），男，博士，主治医师，主要从事中西医结合神经系统疾病的研究。

韩 杰，E-mail:hjj.427@163.com。