苹果乳酸发酵生产葡萄酒

冀 雪

（青岛科技大学 化工学院，山东 青岛266042）

英国缺乏光照并且土地酸度过高，不适合生产传统葡萄酒，但正是由于其土地酸度才能生产出独特的起泡葡萄酒。在加拿大酿酒季，严重的霜冻反而可以帮助生产冰酒。德国，捷克和奥地利等气候凉爽的国家都在尝试生产这种特别的葡萄酒。但只能隔几年才能生产，而在加拿大，每年都可以生产这种葡萄酒[1]。

在欧洲国家，应用改造的酿酒工艺有可能大规模生产带有地区特色的洋酒，特别是那些要求高酸度和低香气的葡萄酒。最理想的方案就是进行二次发酵—乳酸发酵（MLF）。葡萄酒生产的首要目标是减弱酸度，增强生物稳定性，改变葡萄酒香气和口感[2]。迄今为止，利用二次发酵大约可以生产75%红葡萄酒和40%白葡萄酒。

1 酿酒工艺中MLF的作用

酿酒过程中最重要的就是酒精发酵。在厌氧条件下，酶催化糖降解，主要产生乙醇和CO2，还有琥珀酸、乙酸和乳酸等有机酸，高级醇，乙醛，酯和甘油等副产物，这些物质会影响葡萄酒的口味和香气。此过程受酵母酸度的影响。

酒精发酵快结束时，可能会自发进行MLF。二次发酵主要用于酿造红葡萄酒，部分用于酿造白葡萄酒和某些水果酒。二次发酵菌株包括乳酸菌，片球菌和明串珠菌。目前，最有效的MLF菌株是酒类酒球菌，该菌株对酒精和低pH有很好的耐受性。二次发酵也叫生物脱氧。苹果酸口感较酸，而乳酸口感较温和，生物脱氧是由L(-)苹果酸脱羧转化为L(+)乳酸和CO2，1 g苹果酸能转化成0.67 g乳酸和0.33 g(165 mL)CO2。

酒类酒球菌能合成酸，酒精和酯等代谢物除去植物或草本身的气味，同时使葡萄酒带有水果或花的香气，从而改善葡萄酒的口味、香气和质感。MLF乳酸菌能合成抗菌化合物—类细菌素抑制剂 (BLIS)，可明显减弱其它乳酸菌的生长。酒球菌能有效控制乳酸菌产生的多糖，丁二酮，乙酰甲基原醇，醋酸或乙醛等代谢物的量[3]。

2 MLF所需的条件和技术缺陷

MLF可以获得所需的酸度和弱芳香气味。启动MLF需要温度在20-25℃之间，而在MLF过程中，就需要温度介于18-20℃之间，游离SO2浓度低于 10 mg/L，SO2总浓度低于 30 mg/L，pH介于3.2-3.4之间[4]。酵母在酒精发酵过程会消耗营养物质，因此有必要给未熟酒提供C、N和P。

多酚类化合物会影响二次发酵效果[5]。在梅露汁等葡萄酒品种中发现了不利于MLF的单宁酸,因此需要减少其含量[6]。并不是所有酚类化合物都不利于酒类酒球菌的生长及代谢活性。在酿制过程中香草醛会释放到葡萄酒中，能加快细菌的对数生长期，还可被细菌代谢成其它化合物，从而提高葡萄酒的香气[7]。

抑制MLF的因素与残留农药有关。有研究认为即使数量很小，残留农药也能明显扰乱MLF，甚至会完全抑制[8]。对MLF的抑制作用主要依赖于所选的苹果乳酸细菌菌株，发酵葡萄的种类，酿造技术和所用农药类型：除草剂、杀虫剂、杀真菌剂。

德国、奥地利、捷克等气候凉爽的国家现在开始实施乳酸菌株接种，但仍有大多数国家还仅依赖于未发酵葡萄酒汁自发发酵。对自发发酵的评估主要是根据其味道和口感的变化。发酵过程缺乏控制会产生生物胺类、多糖、丙烯醛、乙酸、D-乳酸、丁二醇、乙醛或等发酵副产物。在葡萄酒生物胺中最重要和最经常出现的是组胺、酪胺、腐胺、尸胺，其次是苯乙胺、亚精胺、胍基丁胺和色胺。由于酿酒技术、原材质地、可能的污染微生物不同，产生的生物胺质量和数量也会有所不同。用商业苹果乳酸起始剂来进行葡萄酒接种会降低合成生物胺的水平。生物胺浓度过大会引起肾上腺素释放、胃酸分泌过多、心脏泵出力增强、偏头痛、心动过速、血糖水平升高和高血压。苹果乳酸能产生胺氧化酶来降低生物胺含量。降解生物胺能力最强的是乳杆菌属和片球菌属中的菌株，但很少有人会注意到这点，因为生物胺主要是由这两类菌产生的。选择合适的酿酒乳酸菌能帮助提高葡萄酒的质量和减少生物胺浓度。现在的葡萄酒工业主要致力于彻底消除葡萄酒中的生物胺。

除生物胺外，另外一个副产物是氨基甲酸乙酯，它是由精氨酸脱氨基作用产生的。乙醇与尿素反应，转化为氨基甲酸乙酯。这种化合物被欧盟议会分类为Ⅱ类致癌物，紧次于乙烯或丙烯酰胺[9]。因此就需要调整酿酒工艺来减少这种物质的合成。

3 MLF的启动

苹果乳酸发酵酿造葡萄酒可能会自发进行，但是此过程是随机的，严重的环境条件可能会推迟或完全阻碍MLF的进行，因此就需要更加严格的控制此过程。葡萄酒还可能会被不良微生物损坏变质，例如乙酸菌、乳酸菌属或接合酵母属、酒香酵母属、德克酵母种中的某些菌株。MLF启动时间受细菌培养基或酵母代谢产物的影响。理论上，MLF可能会在四个不同时间点启动。

3.1 酒精发酵之前

只适用于酿制白葡萄酒，用的是植物乳杆菌，此菌对酒精有很低的耐受度。此过程消耗糖并产生乳酸和其它二次代谢物，但细菌寿命很短。还可能会产生不良物质，降低葡萄酒的质量和合格率[10]。

3.2 酒精化和MLF同步进行

乙醇的强阻碍作用和发酵液的高酸度，使得有些葡萄酒很难进行苹果乳酸发酵。但是有利于乳酸菌生存的环境也使得葡萄酒易被其它微生物破坏而腐败。同步酒精化和MLF会使苹果酸更高效的转化为乳酸。升高温度，降低乙醇浓度和增加葡萄汁营养成分有利于酒精发酵。此外，同步发酵获得的葡萄酒可立即进行分离，澄清和亚硫酸盐化，从而提高微生物稳定性和收率。

3.3 酒精发酵完成之前

在酒精发酵的最后三分之一阶段接种酒类酒球菌，可以充分利用发酵产生的热量，并减小葡萄酒变质的风险。

3.4 酒精发酵之后

有利于苹果乳酸菌接种的时刻是淬火发酵，这时残余糖浓度不超过4 g/L，而SO2最大总浓度是30 mg/L。虽然此过程风险最低，但是由于低温，高SO2浓度，低营养物浓度，使得在酒精发酵之后启动MLF变得更加困难。

4 酵母和细菌之间的相互作用

4.1 酿酒酵母对酒类酒球菌的抑制作用

酒精主要由酵母合成。其浓度影响细菌生长，从而影响MLF。高于8%v/v的酒精能明显降低细菌生长速率，但不影响代谢苹果酸的速率。用于转化苹果酸的细菌初始浓度很低。酒精与其他抑制剂联合使用可能会更有效地抑制MLF[11]。

SO2在酿制葡萄酒中非常重要。酿酒酵母产生SO2量的多少取决于所用的菌株。大部分菌株产葡萄酒量少于30 mg/L，有些菌株却能产生至少100 mg/L的葡萄酒。在酒精浓度为15 mg/L，pH低于3.5时，游离的SO2能明显降低细胞存活率和增殖能力。SO2与其他抑制剂联合作用，能限制细菌生长，并减弱苹果酸发酵的能力。

酵母产生中链脂肪酸，根据中链脂肪酸的浓度和类型不同，其抑制细菌生长，减弱苹果酸分解代谢能力也有所不同。

胞内阳离子蛋白也可能会抑制MLF。在加热葡萄酒中，并没有发现MLF抑制作用。由此可以推测起抑制作用是蛋白质，它们在高温下易变性。

酵母对细菌的抑制还可能与营养物质消耗有关。缺乏氨基酸不利于MLF细菌活性。酵母细胞自溶导致氨基酸不足，从而延迟MLF的启动。增加氨基酸的量，可以启动MLF，但也可能会产生过量的尿素—氨基甲酸乙酯的前体，具有致癌作用，因此必须严格控制它们的量。

4.2 酿酒酵母对酒类酒球菌的刺激作用

酵母不总是抑制苹果乳酸细菌生长和代谢活性。背风保存条件下酵母细胞溶解，使得很多氨基酸，多肽等氮类化合物释放到未熟酒中，这些物质是细菌细胞生长和获得相应活性所必须的。1000 Da以下的肽类能能促进酒类酒球菌生长，分子量高于12 KDa的蛋白质可能诱导细菌细胞壁上产生氨肽酶[12]。

甘露糖蛋白是酵母细胞分泌出来的另一种化合物。它能吸收中链脂肪酸，起到解毒作用；还能刺激细菌产生水解酶。

4.3 酒类酒球菌对酿酒酵母的抑制作用

苹果乳酸菌对酵母菌抑制作用发生在酒精发酵完成前的细菌接种或诱导MLF自发进行时。细菌消耗营养物质，产生过多乙酸，加速了酵母死亡，从而造成葡萄汁中糖不能完全转化。MLF细菌产生的胞外酶β-1,3葡聚糖酶，能分解酵母细胞细胞壁。细菌还能生物合成BLIS，并且明显的控制微生物区系和最终产品中微生物的稳定性。

5 结语

应用不同的接种方案和酿酒工艺可能使未发酵葡萄汁更好地转化为高质量葡萄酒，然而酿制能否成功主要依赖于选择合适的酵母—细菌组合。

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