促红细胞生成素的表达调控机制及其在慢性病贫血治疗中的应用

孙士鹏刘贵建

·综述·

促红细胞生成素的表达调控机制及其在慢性病贫血治疗中的应用

孙士鹏★刘贵建

促红细胞生成素（EPO）为165个氨基酸残基组成的糖蛋白，主要由胎肝和成人肾皮质的成纤维细胞生成。EPO的表达受到多种转录因子和表观遗传学调控。EPO与其受体结合后主要通过激活Jak2／stat5通路，进而激活Pim、c-Myc、OncostatinM、Bcl-2、Bcl-xL、SOCS和D-type cyclin等基因，在红细胞生成过程中起到抗细胞凋亡和促进细胞增殖等重要作用。使用促红细胞生成剂上调血红蛋白含量，进而改善贫血患者的能量水平和生活质量具有重要意义，但长期使用存在一些副作用。本文对EPO表达调控机制及其在贫血治疗中的应用进行论述。

促红细胞生成素；缺氧；甲基化；贫血

1906年在激素能够通过血液运送到体内较远的组织器官发挥功能的新观点影响下，法国学者Carnot和DeFlandre提出缺氧条件下红细胞生成受到一种激素调控，这种激素命名为促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）［1］。1952年Grant等将氧气敏感型电极植入动物骨髓，贫血情况下骨髓氧分压正常，因而他们认为缺氧条件下红细胞不是直接在骨髓内生成［2］。1953年，Alan Erslev首次将贫血兔子血浆注射正常兔子，发现正常兔子网织红细胞数量增加，证实了EPO的存在［3］。1955年，Plzak等将10ml贫血大鼠的血浆注射正常大鼠后，观察到正常大鼠新形成的红细胞摄取Fe59增多［4］。1957年Jacobson等首次证实肾脏是生产EPO的器官［5］。1977年Miyake和Goldwasser等从再生障碍性贫血患者尿液中纯化出EPO［6］。1985年美国Amgen公司lin等分离纯化了EPO的DNA，在中国仓鼠卵巢细胞成功克隆和表达了EPO［7］。EPO基因的分离与克隆促进了人类重组促红细胞生成素（recombined human erythropoietin，rHuEPO）的诞生。1989年，美国FDA批准rHuEPO应用于临床。

1 EPO的生成及表达调控机制

1．1EPO的生成

EPO编码基因位于7q22，含有5个外显子和4个内含子，编码含193个氨基酸的多肽。在分泌过程中N端的分泌前导肽27个氨基酸和C端精氨酸被剪切掉，余下165个氨基酸残基组成的糖蛋白成为成熟的EPO。EPO糖基化程度很高，糖基成分主要是唾液酸。成人80％的EPO由肾皮质的成纤维细胞生成，20％由肝星状细胞生成，胎儿期EPO主要由肝脏合成［8］。EPO分泌具有昼夜节律，早晨含量最低，中午最高。EPO生成主要由肾脏根据需求感应氧供给的变化［9］：氧气供应减少如高海拔、肺部疾病、肾血流量减少等会刺激机体EPO表达升高，急性缺氧条件下肝脏能分泌超过1／3含量的EPO；氧气供应增多如红细胞增多症、吸入气体氧分增高等等会刺激机体下调EPO表达；氧气需求下降如甲状腺功能减退症和垂体功能低下患者的氧输送率增高，EPO生成和血清EPO滴度下降［10］。此外，雄激素类固醇、合成代谢类固醇和氯化钴等也能刺激促EPO生成［11-14］，但是机制尚不明确。因此，进一步研究EPO生成机制对全面深入了解EPO的表达调控具有重要意义。

1．2EPO的生物学功能

1．2．1促红细胞生成的机制

红细胞成熟经历早期暴增式红细胞集落生成单位（burst-forming unit，erythroid，BFU-E）和红细胞集落形成单位（colony-forming unit，erythroid，CFU-E）期。缺氧条件下，肾脏EPO基因转录激活，分泌量增高。EPO与多种生长因子（SCF，GM-CSF，IL-3和IGF-1）协同作用能够促进红系祖细胞CFU-E成熟前增殖4～5倍［15］。EPO的受体（EPO receptor，EPOR）属于I型细胞因子家族，主要在红系前体细胞表达［16］，多能造血干细胞和BFU-E细胞不表达EPOR［17］。肺、睾丸间质细胞、脾、内皮毛细血管、脑、子宫、输卵管及B淋巴细胞和巨核细胞均可分泌少量的EPO及EPOR［18］。EPOR和EPO结合后可激活Jak2／stat5通路、PI3K／Akt和Ras／ERK信号通路［19］。其中Jak2／stat5通路在红系增殖中至关重要，Epo／EpoR或Jak2中任一蛋白缺陷都会造成小鼠红系生成缺陷，胚胎期致死。酪氨酸激酶JAK2（Janus kinase）为非跨模型，胞外区两条多肽链形成同源二聚体使受体偶联的JAK2激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化，磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位点”。含有SH2结构域的STAT5蛋白被招募到这个“停泊位点”，被JAK2磷酸化后发生二聚化，然后穿过核膜进入细胞核内与靶基因启动子结合调控。Stat5的靶基因包括Pim、c-Myc、OncostatinM、Bcl-2、Bcl-xL、SOCS和D-type cyclin基因，这些基因在红细胞生成过程中起到抗细胞凋亡和促进细胞增殖等重要作用［19］。

除EPO外，许多细胞因子包括催乳激素、生长激素、白血病抑制因子（LIF）、睫状神经因子（LIF）、瘦素、血小板生成素和白介素2、3、5、6等刺激时，Stat5都可被激活。Stat5具有不同的Ser磷酸化形式，用不同的激素或生长因子刺激细胞时，Ser磷酸化形式不一样，激活下游的基因则不相同。研究发现在多种肿瘤细胞中发现stat5持续激活，这会导致stat5激活下游的基因的表达，这些基因往往发生突变能够促进肿瘤细胞增殖。由此可见由EPO激活的Jak2／stat5通路也是一把双刃剑。

1．2．2EPO的其他作用

EPO可通过抗凋亡、抗炎症活性对急性或亚急性期损伤的脑、心、肾等组织细胞具有保护作用。中枢神经系统EPO由神经胶质细胞产生，EPOR则在神经元表达。在脑脊液中能够检测到EPO，正常组织氧合下肾脏产生的EPO不能够穿过血脑屏障，说明EPO在中枢神经系统可能是通过旁分泌的方式参与神经元抗缺氧诱导损伤［20］。许多体内外研究也证实EPO对缺血、缺氧、蛛网膜下腔出血造成的脑损伤具有神经保护作用［21，22］。EPO还可协同血小板生成素促使巨核细胞成熟和血小板的生成增多、激活血管内皮细胞、上调参与血栓形成分子的表达。EPO还能刺激血管平滑肌痉挛，从而降低了局部血流量和失血。持续EPO刺激能够诱导血管生成［23］。

1．3EPO的表达调控机制

1．3．1转录因子水平的调控

EPO的表达受到多种转录因子的调控：缺氧诱导因子（HIF）、肝细胞核因子-4（HNF-4）激活EPO的表达，转录因子GATA-2、NF-κB则抑制EPO的表达［24］。缺氧下EPO表达的上调主要由HIF诱导表达。HIF由氧调α亚基（HIF-1α，-2α，-3α）和核-β亚基（HIF-1β，2β，3β）亚基组成的二聚体，能够同缺氧反应元件（HRE）保守RCGTG核心序列结合。氧气、铁离子浓度和抗坏血酸盐-依赖性双加氧酶（也称脯氨酰羟化酶，PHD）调控HIF的活性：常氧下，对氧敏感的PHD催化HIF-α羟基化反应，VHL（Von Hippel-Landau）E3连接酶分别识别HIF-α两个脯氨酸羟基化（PRO-OH）位点即C端-氧依赖性降解结构域（CODDD）和N端-氧依赖性降解结构域（NODDD）［25］。随后VHL E3连接酶介导泛素化依赖性HIF-α蛋白降解，致使HIF-α蛋白维持低水平。此外，天冬酰胺酰羟化酶FIH能够通过羟化和抑制HIF-α招募转录共激活因子P300和CBP来抑制HIF-α转录。在缺氧条件下，PHD／FIH-介导的羟基化作用被抑制，HIF-1α蛋白含量增高并进入细胞核与EPO编码基因的HRE序列结合，与HIF-1β、共激活因子P300和CBP协同诱导EPO的表达［26］。

1．3．2表观遗传学调控

EPO的启动子和增强子区域均含有CpG岛，甲基化修饰能够调控EPO的表达。缺氧条件下诱导EPO表达可以观察到组蛋白H3乙酰化增加和组蛋白H3赖氨酸9三甲基化降低［27］。启动子和增强子区域高度甲基化的EPO会导致常氧和缺氧下其报告基因表达的降低［27］。在大多数人类肿瘤细胞系的EPO基因甲基化程度高于正常组织。高度甲基化的EPO同转录因子HIF-1的结合所需要的能量高于低甲基化和非甲基化区域，因而高度甲基化会使转录因子和DNA结合不稳定，致使基因沉默［28］。

EPO和EPOR也受到microRNA（miRNA）的调控，miRNA-125b作为一种抑癌miRNA在多数实体瘤乳腺癌、肺癌、肝癌、甲状腺癌、卵巢癌、宫颈癌、黑色素瘤及神经母瘤中低表达或缺失，仅在少数实体瘤如胃癌和胰腺癌中高表达［29］。乳腺癌等细胞中转染miRNA-125b能够抑制EPO和EPOR的表达。

综上所述，EPO能够调控红系细胞生成，EPO和EPOR本身的表达也受到多种转录因子及表观遗传的调控。EPO表达调控机制的深入研究对EPO在临床治疗中的应用具有重要指导意义。

2 EPO与慢性病贫血

世界卫生组织（WHO）对贫血的定义为女性血红蛋白含量＜12 g／dL，男性血红蛋白含量＜13 g／dL［30］。随着年龄的增长贫血发病率和患病率也增高。一项对贫血患病率和发病率纵向研究发现65岁贫血的患病率为5％～7％，随着年龄的增长，80岁以上则超过40％的人贫血，绝大多数为轻度贫血，重度贫血患病率小于0．5％的人（Hb＜80 g／L）［31］。机体随着年龄增长EPO含量也增高，非糖尿病、肾功能不全或高血压的健康个体EPO增高的斜率高于贫血患者［32］。贫血初期EPO生成的增多的补偿机制足以维持血红蛋白水平，但是过表达的EPO被消耗后不能够维持血红蛋白正常水平就会出现贫血的临床症状。重度贫血患者必须要纠正，尤其是年龄大于65岁伴有危险因子（如冠状动脉疾病，肺疾病，慢性肾脏病）的患者。肾功能衰竭接受透析和接受化疗癌症患者，血红蛋白水平校正到120 g／L升后生活质量才能得到改善［33］。为了使血红蛋白含量维持一定水平，CRP＞20 mg／L的慢性肾病患者接受EPO的剂量要比CRP低的患者高出30％～70％［34］。

慢性病贫血（anemia of chronic disease，ACD）是一类感染、肿瘤、自身免疫病等疾病引起的铁缺乏而导致的继发性造血障碍性疾病，是贫血的一种疾病类型。ACD根据病情严重程度主要分为轻度ACD（血红蛋白浓度＞100 g／L）或中度ACD（85～100 g／L）。仅有少数患者可发生血红蛋白严重减少。ACD病理生理机制则是多方面的，主要特征是铁代谢紊乱，网状内皮系统的细胞摄取和滞留铁增加，血清铁含量下降和红系祖细胞增殖和分化受损，以及促红细胞生成素（EPO）反应性受损［35］。炎症可能会抑制EPO信号通路或者通过骨髓内功能缺陷的方式阻止对EPO的反应。

EPO和输血均为治疗肿瘤患者贫血的主要手段，EPO治疗肿瘤相关性贫血中国专家共识（2010-2011版）指出：多年来，输注全血或红细胞是治疗肿瘤相关性贫血的主要方式，其主要优点是可以迅速升高血红蛋白水平、可用于EPO治疗无效的病人以及较EPO治疗成本低。但是也存在多次输血容易引起过敏性反应、急性溶血反应、同种异体免疫反应、血量超常和非心源性肺水肿以及潜在的病毒感染风险。但是，EPO治疗的主要目标是减少输血。从90年代开始促红细胞生成素类药物（ESA）治疗成为治疗肿瘤相关性贫血的最重要方法。EPO是临床上最常用也是研究最多的ESA类药物。EPO治疗的主要优点是符合正常生理、生活质量明显改善、可用于门诊病人以及耐受性好。50％的癌症患者接受促红细胞生成因子治疗后能够上调血红蛋白含量，进而改善患者能量水平和生活质量，降低疲劳［36］。EPO水平在促红细胞生成剂治疗ACD反应时具有预测价值。需要指出的是血红蛋白水平大于100 g／L的患者EPO含量多在正常范围，通过EPO含量预测促红细胞生成剂治疗ACD反应效果时，应注意患者血红蛋白水平是否低于100 g／L。如果不考虑患者贫血程度和血红蛋白含量仅通过EPO含量来预测促红细胞生成剂治疗效果，结果会不准确。例如一项研究发现，未接受化疗的癌症患者重组EPO治疗两周后虽然血清EPO高于100 U／L（或铁蛋白高于400 ng／mL），但是约88％患者治疗无效［37］。

3 结语

EPO在促红细胞生成和通过抗凋亡、抗炎症活性对急性或亚急性期损伤的脑、心、肾等组织细胞具有保护作用。EPO的表达受到转录因子、甲基化和miRNA-125b的调控。使用促红细胞生成剂上调血红蛋白含量，进而改善贫血患者的能量水平和生活质量具有重要意义。但是EPO的长期使用也会有一些副作用，如动脉高血压、视网膜病变、血栓作用和冠状血管收缩等［38］。EPO能够上调内皮缩血管肽的生成，改变前列腺素浓度以及刺激肾素和血管紧张素的生成。在肿瘤等疾病中，EPO通过自分泌／旁分泌信号通路调节癌细胞的生存和增殖。如何合理利用EPO改善贫血患者生活之而同时有效规避其副作用？笔者认为在通过对EPO表达调控机制的深入研究基础上，对患者相关表达调控因子进行个体化的基因诊断会对个体化治疗及疗效评测具有指导意义。

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Research progress of EPO regulation mechanism and its application in the treatment of anemia of chronic disease

SUN Shipeng★，LIU Guijian
（Clinical Laboratories，Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China）

Erythropoietin（EPO）is a glycoprotein composed of 165 amino acid residue that is mainly produced in the fetal liver and adult kidney cortex fibroblast．The binding of EPO and its receptor can activate Jak2／stat5 pathway．Several important Stat5 target genes，such as Pim，c-Myc，OncostatinM，Bcl-xL SOCS or D-type cyclins are required for functional erythropoiesis．The expression of EPO is regulated by a variety of transcription factors and epigenetic regulation．Erythropoiesis-stimulating agents（ESA）can increase hemoglobin levels，and thus improve the energy level and quality of life in patients with anemia，but the long-term use of ESA also has some side effects．In this paper，the EPO expression regulation mechanism and its application in the treatment of anemia of chronic disease is discussed．

Erythropoietin；Hypoxia；Methylation；Anemia

卫生公益性行业科研专项（201202004）；中国中医科学院广安门医院国家中医临床研究示范基地科研专项暨所级科研基金课题（2014S305）

中国中医科学院广安门医院检验科，北京100053

★通讯作者：孙士鹏，E-mail：shipengsun＠gmail．com