不同标本巨细胞病毒检测在诊断小儿人巨细胞病毒感染中的应用

翁玉英倪琛林秀凤郑苗黄海龙

·论著·

不同标本巨细胞病毒检测在诊断小儿人巨细胞病毒感染中的应用

翁玉英★倪琛1林秀凤1郑苗1黄海龙2

目的探讨尿液、淋巴细胞和母乳的HCMV-DNA检测以及血清HCMV-IgM检测在小儿人巨细胞病毒（HCMV）感染诊断中的意义。方法用实时荧光定量PCR检测189例疑似HCMV感染患儿尿液、淋巴细胞和母乳的HCMV-DNA，用化学发光法检测其血清HCMV-IgM，并分年龄分性别对其阳性率进行分析比较。结果新生儿组母乳HCMV-DNA阳性检出率（60．3％）显著高于尿液（5．2％，P＜0．001）和淋巴细胞（12．1％，P＜0．001），也显著高于血清HCMV-IgM阳性率（3．4％，P＜0．001）；婴儿组母乳（48．1％）与尿液（55．0％）HCMV-DNA阳性率差异无统计学意义（P＞0．05），但两者均显著高于淋巴细胞HCMV-DNA阳性率（22．1％，P＜0．001）和血清HCMV-IgM阳性率（24．4％，P＜0．001）；婴儿组的尿液HCMV-DNA、血清HCMV-IgM阳性率均显著高于新生儿组（P＜0．01）；两组各指标男女阳性率差异均无统计学意义（P＞0．05）；母乳HCMV-DNA阳性率与尿液、淋巴细胞HCMV-DNA阳性率及血清HCMV-IgM阳性率均呈显著正相关（r＝0．630，P＝0．000；r＝0．413，P＝0．000；r＝0．341，P＝0．000）。结论联合尿液、淋巴细胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM检测有助于患儿HCMV感染的辅助诊断；在无法联合检测的条件下，婴儿首选尿液HCMV-DNA检测可获得较高检出率；母乳HCMVDNA检测并正确喂养有助于预防HCMV感染。

人巨细胞病毒；实时荧光定量PCR；婴儿；新生儿

人巨细胞病毒感染症是由人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）引起的先天性或后天性感染。我国是人巨细胞病毒感染的高发区，平均感染率高达80％～90％。孕妇在妊娠期间的感染多无明显症状和体征，表现为隐性感染，少数感染后可导致流产、早产、死胎、胎儿宫内发育迟缓等；而对于免疫机制发育不成熟的新生儿和婴儿，则可产生肝炎、肺炎、脑膜脑炎、智力低下和先天性耳聋等严重的感染症状［1，2］。

因此，小儿HCMV感染的早期诊断和治疗非常重要。本文用实时荧光定量PCR（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）同时检测疑似HCMV感染患儿尿液、淋巴细胞和母乳的HCMV-DNA，用化学发光法检测其血清HCMV-IgM，并分年龄、性别对各检测阳性率进行分析比较，探讨上述不同标本不同检测指标在小儿HCMV感染诊断中的意义。

1 对象与方法

1．1对象

研究对象为2013年7月～2014年6月在福建省妇幼保健院新生儿科和儿科住院治疗的疑似HCMV感染患儿189例，年龄在1周岁以内。其中新生儿组（年龄在0～28天）58例，男34例，女24例；婴儿组（年龄在29天～12月）131例，男81例，女50例。收集其EDTA抗凝的全血、尿液和母乳标本用于HCMV-DNA检测，血清标本用于HCMV-IgM检测。

1．2主要试剂和仪器

人巨细胞病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司，由美国AB7500荧光定量PCR仪检测；人巨细胞病毒IgM抗体由意大利Liaison全自动化学发光分析仪及其配套试剂检测。

1．3方法

1．3．1FQ-PCR法检测淋巴细胞HCMV-DNA

加1 mL EDTA抗凝全血到装有1 mL生理盐水的离心管中，轻微混匀，并将此2 mL混合血液沿试管壁缓缓加入到装有1 mL淋巴细胞分离液的试管中，不能震荡混匀，2 000 rpm离心20分钟，用加样枪吸出中间的淋巴细胞层于离心管中，12 000 rpm离心5分钟，去上清，于沉淀物中加入50 μL DNA提取液打匀，瞬时离心数秒，100℃保温10分钟，12 000 rpm离心5分钟，取上清2 μL做PCR扩增。其扩增条件和步骤严格按照试剂盒和仪器说明书，下同。

1．3．2FQ-PCR法检测尿液HCMV-DNA

将尿液标本轻轻颠倒混匀，用加样枪吸100 μL加入到装有100 μL DNA浓缩液的离心管中，震荡混匀，12 000 rpm离心10分钟，去上清，于沉淀物中加入20 μL DNA提取液打匀，瞬时离心数秒，100℃保温10分钟，12 000 rpm离心5分钟，取上清2 μL做PCR扩增。

1．3．3FQ-PCR法检测乳汁HCMV-DNA

取1 mL乳汁于离心管中，12 000 rpm离心5分钟，去上清，于沉淀物中加入50 μL DNA提取液打匀，瞬时离心数秒，100℃保温10分钟，12 000 rpm离心5分钟，取上清2 μL做PCR扩增。

1．3．4化学发光法检测血清HCMV-IgM

取患儿静脉血于促凝管中，凝固后离心取上清。其检测步骤严格按照试剂盒说明书和仪器操作规程。

1．4结果判断

HCMV-DNA以增长曲线呈典型的S曲线且实验定量结果＞500 copies／mL为阳性，否则为阴性；HCMV-IgM以≥18 U／mL为阳性，＜18 U／mL为阴性。所有实验数据均在阴、阳性对照和室内质控在控的前提下获得。

1．5统计学分析

采用SPSS 17．0统计软件包对数据进行分析。阳性率的比较采用χ2检验或Fisher's确切概率法，阳性率的相关性分析采用Spearman相关检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1新生儿组尿液、淋巴细胞和母乳HCMVDNA以及血清HCMV-IgM阳性检出率比较

表1所示，新生儿组58例疑似HCMV感染的患儿中，母乳HCMV-DNA阳性检出率（60．3％）显著高于尿液（5．2％，χ2＝40．07，P＜0．001）和淋巴细胞（12．1％，χ2＝29．26，P＜0．001），也显著高于血清HCMV-IgM阳性率（3．4％，χ2＝43．22，P＜0．001）。而尿液、淋巴细胞HCMV-DNA与血清HCMVIgM阳性检出率差异均无统计学意义（P＞0．05）。

2．2婴儿组尿液、淋巴细胞和母乳HCMV-DNA以及血清HCMV-IgM阳性检出率比较

表1所示，婴儿组131例疑似HCMV感染的患儿中，母乳（48．1％）与尿液（55．0％）HCMV-DNA阳性率差异无统计学意义（χ2＝1．24，P＞0．05），但两者均显著高于淋巴细胞HCMV-DNA阳性率（22．1％；分别为：χ2＝19．37，P＜0．001；χ2＝29．79，P＜0．001）和血清HCMV-IgM阳性率（24．4％；分别为：χ2＝15．87，P＜0．001；χ2＝25．51，P＜0．001）。

2．3新生儿组和婴儿组HCMV-DNA和HCMVIgM阳性检出率比较

婴儿组的尿液HCMV-DNA阳性率、血清HCMV-IgM阳性率均显著高于新生儿组（分别为：χ2＝41．64，P＜0．001；χ2＝11．99，P＜0．01），而淋巴细胞HCMV-DNA阳性率、母乳HCMV-DNA阳性率则与新生儿组差异无统计学意义（分别为：χ2＝2．64，P＞0．05；χ2＝2．42，P＞0．05）。

2．4不同性别HCMV-DNA和HCMV-IgM阳性检出率比较

在新生儿组及婴儿组内，男患儿与女患儿的尿液、淋巴细胞、母乳HCMV-DNA阳性率和血清HCMV-IgM阳性率差异均无统计学意义（P＞0．05）。

表1189 例患儿尿液、淋巴细胞和母乳HCMV-DNA以及血清HCMV-IgM阳性检出率（n＝189）Table 1Positive rates of HCMV IgM in sera and HCMV DNA in urine，blood lymphocytes and mother's breast milk（n＝189）

2．5母乳HCMV-DNA阳性率与尿液、淋巴细胞HCMV-DNA阳性率及血清HCMV-IgM阳性率的相关性

在母乳HCMV-DNA阳性的98例样本中，尿液HCMV-DNA阴性的30例，淋巴细胞HCMVDNA阴性的64例，血清HCMV-IgM阴性的68例；在母乳HCMV-DNA阴性的91例样本中，尿液HCMV-DNA阳性的7例，淋巴细胞HCMV-DNA阳性的2例，血清HCMV-IgM阳性的4例。经Spearman等级相关分析发现，母乳HCMV-DNA阳性率与尿液、淋巴细胞的HCMV-DNA阳性率及血清HCMV-IgM阳性率均呈显著正相关，相关系数和P值分别为：r＝0．630，P＝0．000；r＝0．413，P＝0．000；r＝0．341，P＝0．000。参见表2。

表2 母乳HCMV-DNA阳性率与尿液、淋巴细胞HCMV-DNA阳性率及血清HCMV-IgM阳性率的相关性（n＝189）Table 2 Relations of HCMV DNA positive rate in mother's breast milk with those in urine，blood lymphocytes and HCMV IgM in sera（n＝189）

3 讨论

人巨细胞病毒（HCMV）是人类先天性病毒感染中最常见的病原体之一［3］。人体感染HCMV以后3～5天即可出现IgM抗体，其阳性是诊断早期感染的可靠指标，并表明为活动性感染［4］，但其产生的多寡受体内HCMV感染量、宿主的免疫反应状态等影响。本研究结果显示，婴儿组尿液HCMV-DNA阳性率（55．0％）显著高于淋巴细胞HCMV-DNA阳性率（22．1％，P＜0．001）和血清HCMV-IgM阳性率（24．4％，P＜0．001）。一方面，这可能是由于新生儿和婴儿机体免疫系统发育不完善，产生IgM的能力较弱，导致假阴性结果出现，同时IgM阳性也可能是受类风湿因子和IgG竞争抗原的干扰而造成的假阳性［5，6］；而另一方面，尿液HCMV-DNA阳性率高可能是由于HCMV最易侵犯肾脏和肝胆系统管道上皮细胞，HCMV在肾小球和肾小管上皮细胞内复制，且肾脏具有浓缩功能，使尿液有一定浓度的HCMV排出。

HCMV是双链DNA病毒，属于疱疹病毒属，对宿主或组织培养细胞有明显的种属特异性，HCMV可存在于人体内皮、上皮、平滑肌等多种细胞中，肝、肺、肾、胰是HCMV的主要靶器官［7］。CMV感染者是唯一的传染源，病毒可从宿主尿液、宫颈及阴道分泌物、乳汁、精液和血液等多个部位排出此病毒［8］。本研究结果显示，新生儿组尿液HCMVDNA阳性率仅为5．2％，与de Vries等［9］报导的8．2％接近，且与淋巴细胞HCMV-DNA（12．1％）和血清HCMV-IgM（3．4％）阳性检出率差异均无统计学意义（P＞0．05）。这是否是由于新生儿肾脏浓缩功能弱而导致的假阴性结果，还有待于进一步研究。de Vries等［9］认为对于免疫力不全的新生儿，尿液HCMV-DNA定量PCR比病毒培养具有更高灵敏度，也可作为诊断HCMV感染的金标准。

母乳HCMV-DNA阳性证明患儿母亲有HCMV感染并从乳汁排毒。本研究结果显示，母乳HCMV-DNA阳性率与尿液、淋巴细胞HCMVDNA阳性率及血清HCMV-IgM阳性率均呈显著正相关（r＝0．630，P＝0．000；r＝0．413，P＝0．000；r＝0．341，P＝0．000），这提示患儿HCMV感染与母乳传播有关。但从实验中我们也看到，母乳HCMV-DNA阴性患儿也有尿液、淋巴细胞HCMV-DNA阳性和血清HCMV-IgM阳性的病例，而且有的患儿特别是新生儿母乳喂养时间很短甚至缺乏。这也证实母乳传播不是患儿HCMV感染唯一途径，它也可通过经产道感染、胎盘传播、接触传播或医源性传播［8，10］。母乳（特别是初乳）营养丰富，是婴儿的最佳食品，是任何乳制品不可替代的，对婴儿健康成长十分有益。对已感染HCMV的婴儿可继续母乳喂养，无需处理；对早产儿和低出生体重儿则需将带病毒母乳-20℃冻存1 d，再加巴斯德灭菌法（62．5℃）消除病毒感染性后再喂养［11，12］。综上所述，在婴儿组，尿液HCMV-DNA阳性率显著高于淋巴细胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM阳性率，但也有发现尿液HCMV-DNA阴性而后两者阳性的病例；在新生儿组，HCMV-DNA或HCMV-IgM阳性的9例患儿中，仅1例尿液HCMV-DNA、淋巴细胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM三者均阳性。单一标本或单一指标容易漏检HCMV。HCMV感染具有间歇性、多部位排毒的特点，且因感染部位不同和个体差异，在不同标本所释放的病毒量也不同。因此，联合尿液、淋巴细胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM检测有助于患儿HCMV感染的辅助诊断。在无法联合检测的条件下，婴儿首选尿液HCMV-DNA检测可获得较高检出率。患儿HCMV感染与母乳传播有关，母乳HCMV-DNA检测并正确喂养有助于预防HCMV感染。

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Diagnostic significance of detections of human cytomegalovirus in different specimens for baby infection

WENG Yuying★,NI Chen,LIN Xiufeng,ZHENG Miao,HUANG hailong
(1.Clinical Laboratory,Maternal and Child Health Hospital of Fujian,Fuzhou,Fujian,China,350001; 2.Prenatal Diagnosis Center,Maternal and Child Health Hospital of Fujian,Fuzhou,Fujian,China,350001)

ObjectiveTo study the diagnostic significance of detection of human cytomegalovirus (HCMV)IgM in sera,and HCMV DNA in urine,blood lymphocytes and mother's breast milk for baby infection.MethodsChemiluminescence technology was used to detect the specific HCMV IgM antibody in sera and fluorescent quantitative PCR was used to detect HCMV DNA simultaneously in urine,blood lymphocytes and the mother's breast milk of 189 infants with suspected HCMV infection.The positive rates in these specimens were analyzed in either newborn group(less than 28 days old)or infant group(from 29 days to 12 months old),as well as boy group and girl group.ResultsIn newborn group,the positive rate of HCMV DNA in mother's breast milk(60.3％)was higher than those both in urine(5.2％,P＆lt;0.001)andin blood lymphocytes(12.1％,P＆lt;0.001).In infant group,no statistical difference was detected between the positive rates of HCMV DNA in mother's breast milk(48.1％)and that in urine(55.0％),which were higher than that in blood lymphocytes(22.1％)and the positive rate of HCMV IgM in sera(24.4％).In infant group,the positive rate of HCMV DNA in urines and that of HCMV IgM in sera were higher than those in newborn group(P＆lt;0.01).No statistical difference between boy group and girl group was detected in all specimens.The positive rate of HCMV DNA in mother's breast milk showed significant positive correlations with those of all other specimens(P＆lt;0.001).ConclusionsCombined detection of HCMV IgM in sera and HCMV DNA in urine,blood lymphocytes and mother's breast milk would contribute to auxiliary diagnosis of baby with HCMV infection.If it is not available to detect all these samples,detection of HCMV DNA in urine of infant may be the first choice.Detection of HCMV DNA in mother's breast milk and breastfeeding in a correct way would contribute to the prevention of HCMV infection.

Human cytomegalovirus;Fluorescent quantitative PCR;Infant;Newborn

福建省科技厅自然科学基金项目（2012J01311）；福建省卫计委中青年骨干人才培养资助项目（2013-2QN-2D-6）

1．福建省妇幼保健院检验科，福建，福州350001 2．福建省妇幼保健院产前诊断中心，福建，福州350001

★通讯作者：黄海龙，E-mail：hl-hai＠163．com