针刺对缺血脑组织谷氨酸含量及其代谢型受体5mRNA表达水平影响的实验研究

赵海军 王媛 卢岩 韩冰冰 李燕，2 王世军

（1.山东中医药大学，山东济南 250355；2.齐鲁工业大学化学与制药工程学院，山东济南 250353）

针刺对缺血脑组织谷氨酸含量及其代谢型受体5mRNA表达水平影响的实验研究

赵海军1王媛1卢岩1韩冰冰1李燕1，2王世军1

（1.山东中医药大学，山东济南 250355；2.齐鲁工业大学化学与制药工程学院，山东济南 250353）

目的：观察针刺对局灶性脑缺血模型大鼠缺血脑组织谷氨酸含量及其代谢型受体5（metabotropic glutamate receptor5，mGluR5）mRNA表达水平的影响。方法：采用线栓法复制大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，将造模成功大鼠随机分为模型组、曲池组、内关组及地机组，并设置假手术组、空白组，每组6只。针刺14d后，脑组织取材，利用酶化学法检测缺血脑组织中谷氨酸的含量，利用RT-PCR检测mGluR5 mRNA的表达水平。结果：与假手术组及空白组相比，内关组、曲池组及模型组大鼠脑组织谷氨酸含量明显升高；与模型组、地机组相比，内关组、曲池组大鼠脑组织内谷氨酸含量明显下降。与假手术组及空白组相比，地机组及模型组大鼠脑组织mGluR5 mRNA表达明显升高；与模型组及地机组大鼠相比，内关组与曲池组大鼠脑组织mGluR5 mRNA表达明显升高。结论：针刺可降低缺血性脑组织谷氨酸含量，上调mGluR5 mRNA的表达水平，从而达到保护缺血性脑组织的作用。

脑缺血 针刺疗法 谷氨酸 mGluR5

谷氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性氨基酸，在突触兴奋传递中及神经元生理功能方面具有重要的作用，同时它又具有很强的神经毒性，参与了缺血性脑中风时神经功能和结构损伤的病理生理过程。有研究报道，其代谢型受体5（mGluR5）亦与该过程有关。因此，我们拟从缺血性脑组织谷氨酸含量及mGluR5mRNA表达方面进行研究，检测针刺对脑中动脉栓塞（MCAO）模型大鼠上述指标的影响，进而探讨针刺对缺血性脑中风的保护机制。

1 实验材料

1.1 实验动物雄性SPF级Wistar大鼠36只，体重（220± 20）g，购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001。SPF级大鼠饲料购自北京科澳协力公司，合格证号：SUXK（京）2009-0012。

1.2 主要实验试剂谷氨酸测定试剂盒，批号A074，购自南京建成生物工程研究所；蛋白含量测定试剂盒，批号A045-2，购自南京建成生物工程研究所。Trizol及RT-PCR试剂盒由Invitrogen（美国）公司生产。

1.3 主要实验仪器GS-15R型高速低温离心机，Beckman；UV-7504型单光束紫外可见光分光光度计，上海欣茂仪器有限公司；7500 Fast型qPCR仪，Applied biosystems公司；EPS300型电泳仪，Tanon公司；2500型凝胶成像仪，Tanon公司。韩式电针仪，南京济生医疗技术有限公司；I5独立通风大鼠饲养笼，苏州苏杭技术设备有限公司。

1.4 引物合成及序列mGluR5及GAPDH上下游引物委托北京信利来科技有限公司合成，mGluR5上游引物5'-GCAGGGAGCTCTGCTACATTAT-3'，下游引物3'-TGGGCTTCTTGGTACAGATTTT-5'；GAPDH上游引物5'-CATTGTCACCAACTGGGACGATA-3'，下游引物3'-GGAGGCTACGTACATGGCTG-5'。

2 实验方法

2.1 造模与分组采用文献[1]记载的方法进行MCAO模型复制及假手术操作，并在大鼠苏醒后参照文献[2]进行神经体征评分，将评分为1～3分的大鼠随机配伍分组为模型组、内关组、曲池组、地机组，每组8只。进行假手术操作的大鼠8只为假手术组。另取8只大鼠作为空白组。

2.2 针刺方法依据文献[3]制定的标准对“内关”、“曲池”及“地机”取穴，前两穴作为治疗穴，以地机穴作为无关对照穴，该穴定位于阴陵泉穴下3mm，内踝最尖部与阴陵泉穴的连线上。针刺内关时，直刺1mm；针刺曲池和地机时，直刺4mm。提插捻转行针后连接在韩式电针仪上。电针仪参数设置同参考文献[2]。造模完成后，于每日上午针刺1次，连续针刺14d。对模型组及假手术组大鼠实施抓取、捆绑等假针刺操作。空白组不做任何操作。

2.3 取材末次针刺2h后，处死取脑，于缺血侧大脑中动脉起始端前后8mm切一脑片。

2.4 脑组织谷氨酸含量测定制备脑组织匀浆，用于谷氨酸含量检测，检测方法按照试剂盒说明书进行。

2.5 脑组织mGluR5 mRNA的表达水平检测参照试剂盒说明书提取上述脑组织匀浆的总RNA，核酸测定仪测A260/ A280，要求在1.8～2.0之间，以保证RNA纯度。

逆转录反应：取RNA0.2μg作为反应模板，加入RNAase-feee水补充至10μL，加入Oligo（dT）1μL，随机引物1μL，以上反应体系于65℃反应5min，冰浴2min后在该体系中继续加入dNTP（10μmol/L）1μL，0.1mol/L DTT 1μL，5×逆转录缓冲液1μL，逆转录酶1μL，以上反应体系在50℃温育5min。

qPCR扩增反应：在ABI 7500 Fast qPCR仪上进行扩增反应，反应体系中加入cDNA模板1μL，10倍扩增反应缓冲液1μL，MgCl2（25mmol/L）1μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，Sybgreen（20×）1μL，DEPC水12.8μL，聚合酶0.2μL。反应体系参数为95℃2min，94℃20s，60℃20s，72℃30s。PCR扩增反应共进行40个循环。实验结果以空白组作为参照，以GAPDH作为内参，以2-△△Ct法进行相对定量分析。

2.6 统计学方法实验结果采用SPSS19.0软件包进行统计分析，结果采用（±s）表示，针刺治疗后各组间两两比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有显著性。

3 实验结果

3.1 针刺对缺血脑组织谷氨酸含量的影响结果见表1。模型组缺血脑组织中的谷氨酸含量明显升高，与假手术组相比差异具有显著性（P＜0.05）。内关组与曲池组脑组织内谷氨酸含量明显下降，与模型组及地机组相比差异具有显著性（P＜0.05）；内关组与假手术组及空白组相比没有显著性差异（P＞0.05）。

3.2 针刺对脑缺血组织mGluR5 mRNA表达的影响结果见表1。与假手术组比较，内关组、曲池组及模型组大鼠脑组织mGluR5 mRNA表达明显升高（P＜0.05）；与模型组、地机组比较，内关组、曲池组大鼠mGluR5 mRNA表达明显升高（P＜0.05），内关组又明显高于曲池组（P＜0.05）；地机组与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠脑组织谷氨酸及mGluR5 mRNA含量比较（±s）

表1 各组大鼠脑组织谷氨酸及mGluR5 mRNA含量比较（±s）

注：*与假手术组比较，P＜0.05；▲与模型组比较，P＜0.05；☆与曲池组比较，P＜0.05；#与地机组比较，P＜0.05。

组别动物数（只）谷氨酸含量（μmol/gprot）空白组mGluR5 mRNA含量8 121.17±22.651.00±0.00假手术组126.56±21.16模型组6221.74±33.81*2.62±0.83*8 1.05±0.05内关组6147.22±34.65▲#5.56±2.49*▲☆#曲池组6188.44±49.42*▲#3.56±2.26▲#地机组6269.93±51.04*1.99±1.70*

4 讨论

谷氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性氨基酸，在突触兴奋传递及神经元生理功能方面具有重要的作用，同时它又具有很强的神经毒性。正常条件下，细胞外谷氨酸水平较低，仅有少量谷氨酸参与信号传递；血脑屏障对谷氨酸的通透性极低，在脑内必须通过糖代谢的中间产物如草酰乙酸、α-酮戊二酸和其他前体经多条化学途径合成[4]。由于能量代谢紊乱，谷氨酸从胞内释出，进入突触间隙激活谷氨酸受体[5]。从而诱使大量Ca2＋内流，引起细胞内钙超载，激活相应级联反应而引发神经毒性[6-7]。同时，某些氧自由基生成的酶类被激活，氧自由基大量生成，则进一步加剧了谷氨酸对细胞的损伤[8]。这种损伤使得细胞膜及线粒体进一步损伤，细胞内K＋更多的从细胞内释出，引起去极化扩散即梗死周围去极化，继而产生神经元过度兴奋性损害作用[9]。

谷氨酸主要通过离子型受体（iGluR）和代谢型受体（mGluR）而发挥作用[10]。其中，mGluR有8种亚型，根据其结构、功能及药理特点可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组。mGluR1和mGluR5共同组成了Ⅰ组，Ⅱ组包括mGluR2和mGluR3，其余亚型组成了Ⅲ组[11]。

目前学者们对mGluR5在缺血性脑损伤中作用和机制的认识并不一致。一部分学者认为，Ⅰ组mGluR可与磷脂酶C结合，水解磷脂酰肌醇为DAG和IP3产生相应效应[12]。一方面，DAG在脑缺血时可被水解形成花生四烯酸，这被认为是谷氨酸参与缺血性脑损伤的机制之一。另一方面，IP3则介导了钙超载的产生。对mGluR5的研究发现，它参与了诸如脑缺血、痴呆等多种疾病过程[13]。

还有研究者发现，mGluR5的激活可减少缺血组织细胞凋亡，起保护作用[14]。陈继军等[15]利用mGluR5激动剂2-氯-4羟苯基甘氨酸对创伤性神经元损伤作用进行了实验研究，发现其可减轻创伤性神经元损伤，这种保护作用可能是由ERK和Akt信号通路介导的。

在本实验中，模型组大鼠脑组织谷氨酸浓度升高，其mGluR5 mRNA含量上调，与空白组及假手术组相比具有显著性差异，提示缺血性脑损伤可引起脑组织的谷氨酸含量上升，而mGluR5 mRNA的表达上调可能与谷氨酸的诱导有关。但经针刺后，与模型组及地机组相比，内关组及曲池组大鼠脑组织谷氨酸浓度降低，此时mGluR5 mRNA表达水平反而升高。该实验结果与刘悦等[16]的研究结果存在差异，其针刺干预脑缺血的研究结果显示，针刺可以降低缺血脑组织mGluR1、mGluR3、mGluR8的水平，但研究中并没有包括mGluR5，但包括了Ⅰ组mGluRs的另外一个亚型即mGluR1，其针刺时间为24h。本课题的针刺天数为14d，因此，我们推测这种差异可能与针刺时间的长短有关。

以上实验结果提示，针刺能够减轻兴奋性氨基酸的神经毒性，从而发挥对缺血脑组织的神经保护作用，而表达升高的mGluR5可能与针刺的神经保护作用有关，但其表达上调的机制及在缺血性脑中风中的作用仍需进一步研究。

[1]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke，1989，20（1）：84

[2]赵海军，王媛，卢岩，等.针刺改善脑缺血“血行不畅、壅遏经脉”血瘀证候的实验研究.辽宁中医杂志，2013，40（12）：2587

[3]Feeney DM，GonzalezA，Law WA.Amphetamine，haloperidol and experience interact to affect rate of recovery after motor cortex injury. Science，1982，217（4562）：855

[4]梅和珊，王永利.脑缺血时谷氨酸释放机制.中国药理学通报，2005，21（4）：393

[5]胡鸣，李芳，徐丹令，等.缺血性脑损伤与兴奋性氨基酸.同济大学学报（医学版），2001，22（3）：73

[6]赵刚，李树清.兴奋性氨基酸毒性与缺血性脑损伤.国外医学（脑血管疾病分册），2004，12（6）：426

[7]牛文民，李忠仁.缺血性脑血管病自由基损伤病原学及抗氧化治疗研究进展.上海针灸杂志，2005，24（1）：43

[8]虞希冲.谷氨酸转运体、谷氨酸/胱氨酸转运体与谷氨酸神经细胞毒作用.中国临床药理学与治疗学，2003，8（5）：490

[9]樊敬峰，王伟斌，吕佩源，等.谷氨酸受体通路及其功能研究进展.疑难病杂志，2005，4（5）：313

[10]宋文婷，徐立，刘建勋，等.脑缺血后谷氨酸及其受体介导的神经细胞损伤及相关药物研究进展.中国药理学通报，2012，28（6）：747

[11]陆钦池，陈生弟.代谢型谷氨酸受体与癫痫的研究进展.神经病学与神经康复学杂志，2006，3（2）：104

[12]张毅，苏敏，秦洁行，等.缺血再灌注大鼠脑内代谢型谷氨酸受体Ⅰ和代谢型谷氨酸受体5的mRNA水平变化.脑与神经疾病杂志，2005，13（4）：264

[14]杨巧莲，张茂林，刘莺，等.局灶脑缺血大鼠代谢型谷氨酸受体5mRNA表达及意义.中风与神经疾病杂志，2008，25（6）：684

[15]陈继军，李随芬，李超，等.选择性代谢性谷氨酸受体5激动剂CHPG对创伤性神经元损伤的保护作用研究.现代生物医学进展，2011，11（24）：4808

[16]刘悦，杨海涛，邝伟川，等.针刺对缺血性脑血管病模型大鼠脑组织代谢型谷氨酸受体的影响.世界中医药，2013，8（2）：193

R743.310.5

A

1672-397X（2014）10-0070-03

赵海军（1978-），男，博士，讲师，研究方向：血瘀证及活血化瘀治法机制研究。

王世军，pathology@163.com

2014-05-09

编辑：吴宁

国家自然科学基金项目（81303053，81373723，81202765，81102652，81072762）；博士点基金博导类资助项目（20103731110006）；山东省自然科学基金项目（ZR2010HM079，ZR2009CQ007）