四二杞乌颗粒对卵巢早衰模型大鼠血清抗苗勒管激素的影响

孙夕平刘冬岩

（1 山西医科大学研究生学院，山西 太原 030001；2 山西医科大学第二临床学院，山西 太原 030010）

四二杞乌颗粒对卵巢早衰模型大鼠血清抗苗勒管激素的影响

孙夕平1刘冬岩2

（1 山西医科大学研究生学院，山西 太原 030001；2 山西医科大学第二临床学院，山西 太原 030010）

目的研究四二杞乌颗粒对雷公藤多甙片（TWP）所致的卵巢早衰（POF）模型大鼠血清抗苗勒管激素（AMH）及性激素的水平变化，探讨抗苗勒管激素（AMH）在早期预测和诊断POF中的价值。方法40只12周龄健康雌性Wistar大鼠随机分为造模组（30只）空白对照组（10只）。造模组成功建立TWP所致的大鼠POF模型后，将模型组随机分为四二杞乌颗粒实验组、己烯雌酚对照组、空白对照组（每组10只），再分别给予四二杞乌颗粒混悬液、己烯雌酚混悬液、等体积的生理盐水（模型对照组和空白对照组）连续灌胃14 d。检测大鼠血清抗苗勒管激素、促卵泡激素、黄体生成素、雌二醇水平，观察大鼠卵巢组织形态和动情周期变化。结果雷公藤多甙片所致的卵巢早衰大鼠血清AMH、E2水平较空白对照组显著降低（P＜0.05），FSH、LH水平较空白对照组显著升高（P＜0.05）；四二杞乌颗粒治疗后，可使大鼠血清AMH、E2、FSH、LH水平接近空白对照组水平，并改善大鼠卵巢组织形态和动情周期。结论四二杞乌颗粒治疗卵巢早衰大鼠效果好，AMH可作为卵巢早衰早期预测和诊断指标之一。

卵巢早衰；四二杞乌颗粒；雷公藤多甙片造模；抗苗勒管激素

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指月经初潮正常或青春期延迟，第二性征发育正常的女性在40岁前发生卵巢功能衰竭，表现为继发性闭经、雌激素水平下降和促性腺激素水平上升。目前趋同的卵巢早衰诊断标准为闭经3～6个月，且至少有2次以上促卵泡激素＞40 mIU/mL及低雌激素水平[1]。卵巢早衰危害妇女健康，导致一系列生殖内分泌及健康问题，使患者丧失生殖能力、生殖器萎缩，长期低雌激素增加了骨质丢失和心血管疾病等风险。目前POF确切的病因尚不清楚，诸多观点仍处于研究阶段[2]。如何防治卵巢早衰，改善卵巢早衰患者生活质量，是目前国内外亟待解决的重要问题。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

由山西医科大学动物中心提供，未交配健康Wistar大鼠40只，12周龄，体质量180～220 g，适应性喂养1周后备用。

雷公藤多甙片（上海复旦浮华药业有限公司，规格10毫克/片，生产批号：120805）；四二杞乌颗粒（方药组成：当归、熟地、川芎、白芍、女贞子、墨旱莲、何首乌、枸杞子，由山西医科大学第二临床医学院中药制剂室制成）；己烯雌酚片（合肥久联制药有限公司，规格1.5毫克/片，生产批号：20100920），抗苗勒管激素试剂盒（上海史瑞可生物科技有限公司）。促卵泡激素试剂盒、黄体生成素试剂盒、雌二醇激素试剂盒（北京华阴生物技术研究所）。

1.2 模型建立及分组

40只大鼠随机分为空白对照组（n=10）和造模组（n=30），将模型组大鼠用雷公藤多甙片悬浮液50 mg/（kg·d）灌胃，连用14 d，空白对照组给予等量的生理盐水灌胃。每日早上9时进行阴道涂片，观察动情周期，大鼠动情周期紊乱，表示大鼠卵巢早衰造模成功。造模成功后，造模组随机分为四二杞乌颗粒实验组、己烯雌酚对照组、模型对照组，每天分别给与2.5 mL四二杞乌颗粒混悬液（含药量2.64 g/mL）、0.08 mg/kg己烯雌酚混悬液、等体积生理盐水灌胃，空白对照组等体积生理盐水灌胃，连用14 d。给药结束后24 h，4组大鼠给予10%水合氯醛麻醉后腹主动脉采血，处死，留取卵巢。

1.3 标本处理与检测

普通光镜下通过阴道涂片观察大鼠动情周期变化。末次给药后24 h采用腹腔注射10%的水合氯醛对大鼠进行麻醉，腹主动脉采血4 mL，离心后取上清液，放置于零下20 ℃冰箱中保存备用。最后颈椎脱臼法处死大鼠，剖腹摘取卵巢子宫，去除周围游离脂肪组织，10%的甲醛溶液固定，做病理切片，电镜下观察其组织形态学改变。用促卵泡激素试剂盒、黄体生成素试剂盒、雌二醇试剂盒放免法检测大鼠血清FSH、LH、E2含量。用抗苗勒管激素试剂盒酶联免疫吸附试验检测大鼠血清AMH含量。

表1 抗苗勒管激素及性激素含量的检测

图1 空白对照组×40

图2 模型对照组×40

图3 四二杞乌颗粒实验组×40

图4 己烯雌酚对照组×40

1.4 统计学方法

采用SPSS18.0软件进行统计数据处理，数据结果均以均数±标准差（）表示，组间比较采用LSD-t检验，检验均采取双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 阴道涂片检查结果：造模前，每只大鼠的动情周期均为4～5天/次，动情间期、动情前期、动情期和动情后期依次交替出现；雷公藤多甙片灌胃后，造模组大鼠动情周期紊乱，动情周期延长6～9 d或持续的动情周期；后期灌药后，己烯雌酚对照组和四物杞乌颗粒实验组大鼠动情周为4～6天/次，各期基本交替出现。

2.2 抗苗勒管激素及性激素含量的检测，见表1。

与空白对照组比较，卵巢早衰模型对照组大鼠血清FSH、LH水平明显升高（P＜0.05），AMH、E2水平明显下降（P＜0.05），差异有显著性；与模型对照组比较，四二杞乌颗粒实验组和己烯雌酚对照组大鼠血清FSH、LH水平明显降低（P＜0.05），AMH、E2水平明显升高（P＜0.05），差异有统计学意义；与己烯雌酚对照组比较，四二杞乌颗粒实验组大鼠血清AMH、FSH、LH、E2水平变化不显著，P＞0.05，差异无统计学意义。

2.3 卵巢组织形态学光镜检测结果

空白对照组（图1）卵巢体积大，卵泡生长活跃，可见初级卵泡，生长卵泡与成熟卵泡各级卵泡，黄体发育好；模型对照组（图2）卵巢体积小，卵泡明显减少，甚至没有成熟卵泡，闭锁卵泡增多，黄体减少；四二杞乌颗粒实验组和己烯雌酚对照组大鼠卵巢体积接近空白对照组，各级卵泡生长良好，闭锁卵泡少。

3 讨 论

中药雷公藤具有抗炎、免疫抑制和抗肿瘤等作用。雷公藤多甙是从雷公藤跟木质部中提取的物质，临床上主要用于治疗类风湿疾病、系统性红斑狼疮等多种自身免疫性疾病。雷公藤多甙片是最早研制成功的、迄今应用最广泛的雷公藤制剂[3]。近年来，随着对雷公藤药理作用的深入认识，其对女性生殖系统的不良反应已经影响到它的广泛应用。有研究表明，在雷公藤制剂的临床应用过程中可诱发药物性闭经，使服药者血清FSH、LH含量达到正常人群绝经期水平，造成高促性腺激素水平的闭经，抑制卵巢E2的分泌[4]。雷公藤多甙片作为一种细胞毒性物质，其对卵巢毒性作用机制可能与其损伤卵巢细胞DNA有关，若DNA损伤严重和（或）DNA损伤不能及时修复，侧可启动细胞凋亡程序[5]。而卵巢细胞凋亡引起的卵泡闭锁加剧是卵巢储备功能降低和卵巢功能早衰的发病机制之一。本实验选用雷公藤多甙片作为卵巢早衰造模用药，考虑其方法简便，周期短，成功率高，重复性好，经济易行，并且大鼠卵巢受损害的病理结果与人类有一致之处。

AMH为二聚体糖蛋白，是转化生长因子β（TGF-β）超家族成员之一，仅表达于性腺，主要由妊娠36周至绝经期的卵巢颗粒细胞分泌（主要为早期生长卵泡、窦前卵泡和小窦状卵泡的颗粒细胞），是目前外周血能检测到最早产生的物质[6]。有研究表明卵巢早衰患者卵巢中窦前卵泡的AMH表达是正常的，而在早窦状卵泡中的表达下降，随着原始卵泡的耗竭，进入生长卵泡期的卵泡数减少，导致分泌入血清中的AMH降低，指明卵巢早衰患者血清AMH水平可用于评估妇女的卵巢储备以及剩余卵泡数，AMH可以作为早期评价卵巢储备降低的理想指标[7]。卵巢储备功能是指卵巢内存留卵泡的数量和质量，反应女性生育能力。卵巢早衰和卵巢储备功能降低互为因果关系，当卵巢储备功能下降后，随着时间的延长和下降水平的增高，会发展到卵巢早衰[8-9]。加强监测评估卵巢储备功能，对早期发现卵巢早衰倾向具有重要临床意义，AMH可调节卵泡发育、反映卵巢储备功能，对卵巢早衰的预测和诊断有一定的应用价值[10]。

本实验是在从肝论治卵巢早衰的基础上的深入研究。四二杞乌颗粒是导师刘冬岩教授根据长期的临床经验和祖国医学理论总结而成。主方由熟地黄、白芍、当归、川芎、旱莲草、女贞子、枸杞子、何首乌八味药组成，具有养肝和血，滋补肝肾的作用。本实验结果表明四二杞乌颗粒可降低FSH、LH水平，升高AMH、E2水平，改善卵巢早衰大鼠卵巢组织形态学和动情周期，改善和恢复卵巢功能。另外，雷公藤多甙片所致的卵巢早衰大鼠血清AMH、E2水平明显降低，FSH、LH水平明显升高，四二杞乌颗粒治疗后，大鼠血清AMH、E2、FSH、LH水平接近正常组水平。这表明，AMH与E2、FSH、LH一起可作为评价卵巢功能的血清学指标。在人类衰老的过程中，血清AMH的降低比FSH的升高能更早的反映卵巢早衰的衰竭。AMH有助于临床卵巢早衰的早期预测和诊断。

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[3] 郝娟,王春莲,王培嵩,等.雷公藤多甙片致卵巢早衰大鼠动物模型的研究[J].中国妇幼保健,2012,27(12):1866-1869.

[4] 高慧,杨涓,韩冰,等.药物型卵巢早衰动物模型的研究[J].国医论坛,2007,22(3):22.

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[8] Tran ND,Cedars MI,Rosen MP.The Role of Anti-Mullerian Hormone (AMH) in Assessing Ovarian Reserve[ J].J Clin Endocrinol Metab,2011,96(12):3609–3614.

[9] Masein N,Mlufi G,Bachelor A,et a1.Evaluation of different markers of the ovarian reserve in patients presenting with premature ovarian failure[J].Md Cell Endocfinol,2008,282(1-2):95-100.

[10] 秦兴玲,叶元,石青峰,等.血清抗苗勒管激素预测卵巢早衰的临床价值[J].中国中西医结合杂志,2010,19(25):3241.

Effect of Sierqiwu Particles on the Premature Ovarian of the Rats Serum AMH

SUN Xi-ping1, LIU Dong-yan2
(1 Graduate School of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2 The Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030010, China)

ObjectiveTo study the changes of serum the anti-Müllerian hormone (AMH) and sex hormones of Sierqiwu particles on premature ovarian failure (POF) rats induced by Tripterygium wilfordii polyglycoside (TWP), and explore the value of the AMH in the early prediction and diagnosis of premature ovarian failure.Methods40 12-week-old female Wistar rats were randomly divided into model group (n=30) and blank control group (n=10), the first three groups to build modules.After establishing successfully rat model of premature ovarian failure with TWP in model group,then they were randomly divided into Sierqiwu particles experimental group, diethylstilbestrol control group, model control group ,and then they were respectively given Sierqiwu particle suspension, diethylstilbestrol suspension, same dose saline (control group and blank model control groups) for 2 weeks. Serum anti-Müllerian hormone(AMH), follicle-stimulating hormone(FSH), luteinizing hormone(LH), estradiol (E2) rat ovarian tissue morphology and estrous cyclewere obtained.ResultThe level of serum AMH ,E2were significantly lower,and FSH, LH significantly increased in premature ovarian failure compared with bank group control; but with the treatment of Sierqiwu particles, serum AMH, E2, FSH, LH levels closed to bank group control (normal levels), and meanwhile improved rat ovarian tissue morphology and estrous cycle.ConclusionEffect of Sierqiwu Particles on the Premature Ovarian in the Rats is actively and AMH can be used as one of the predictors of premature ovarian failure.

POF;Sierqiwu particles; TWP modeling; AMH

R711.75

B

1671-8194（2014）13-0043-03