芍药苷对兔退变椎间盘组织中FasL介导炎性反应的调节作用

史立君 吴春雷 王 靖 滕红林 李 驰 朱旻宇

（温州医科大学附属第一医院，浙江温州 325000）

·实验研究·

芍药苷对兔退变椎间盘组织中FasL介导炎性反应的调节作用

史立君 吴春雷 王 靖 滕红林 李 驰 朱旻宇

（温州医科大学附属第一医院，浙江温州 325000）

目的探讨芍药苷在兔椎间盘内紊乱（IDD）发生过程中对FasL介导的炎性反应的抑制作用。方法取新西兰大白兔96只，雌雄不限，体质量（3±0.5）kg。随机分为4组，每组24只。其中3组行纤维环穿刺造模。造模后各组分别采用芍药苷高［120mg／（kg·d）］、低［30mg／（kg·d）］剂量及生理盐水灌胃治疗，正常对照组采用生理盐水灌胃，分笼常规饲养。分别在术后3、6、10周将各组大白兔处死取材，每组8只，离断腰椎，分离椎间盘。免疫组化法检测FasL、IL－1β及TNF－α的表达并经统计学分析。结果术后3、6、10周时，各造模组的FasL及IL－1β表达均高于正常对照组（均P＜0.01）。芍药苷高、低剂量组的FasL及IL－1β表达低于生理盐水组（均P＜0.05），而高、低剂量组间差异无统计学意义（P＞0.05）。3、6、10周时，各造模组的TNF－α表达均高于正常对照组（均P＜0.01）。3周时，高、低剂量组与生理盐水组差异无统计学意义（P＞0.05）；6、10周时，低、高剂量组的TNF－α阳性细胞率均低于生理盐水组（P＜0.05），而高、低剂量组间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论芍药苷可以抑制FasL表达，进而抑制IL－6及TNF－α等炎性因子的分泌，最终起到抑制髓核细胞凋亡的作用。

椎间盘退变；动物模型；芍药苷；炎性反应；FasL；IL－1β；TNF－α

椎间盘内紊乱（Internal disc disruption，IDD）是椎间盘内的病理改变，而椎间盘的外形没有或仅有极小的改变，当椎间盘突出时（纤维环破裂），则会在局部激发炎症反应，引起髓核退变。髓核细胞通过自分泌或旁分泌途径导致FasL表达增高是可能的机制之一。芍药苷在IDD发生的过程中是否能够干预FasL介导的炎性反应，减轻或延缓椎间盘退变，国内外尚未见报道。本研究旨在通过建立一个兔IDD模型，采用芍药苷对其进行干预，通过检测FasL、IL－1β及TNF－α多项相关指标并进行统计学分析，阐明芍药苷在兔IDD模型中的影响及其作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 新西兰健康大白兔96只，雌雄不限，体质量（3±0.5）kg，由浙江省医学科学院动物实验中心提供（许可证号：Syxk（浙）2008－ 0114），动物质量合格证号（Scxk（浙）2009－0039）。随机分为4组，每组24只。

1.2 仪器 石蜡切片机：德国LAICA公司；OLYMPUS BH－2光学显微镜：日本OLYMPUS公司；OLYMPUS C5060摄像机：日本OLYMPUS公司；ZHJH－1214超净台：苏州净化仪器厂。

1.3 试剂与药物 SABC免疫组化染色试剂盒：福建迈新公司；FasL抗体：Abnova公司；IL－1β及TNF－α抗体：武汉博士德公司；芍药苷（产品批号：国药准字H20055058）：宁波立华制药有限公司。

2 方 法

2.1 兔IDD模型的建立 取新西兰健康大白兔72只，10%水合氯醛（3mL／kg）耳缘静脉注射麻醉，采用腰椎左侧前方倒“八”字入路，钝性分离椎前软组织，暴露脊柱的左前外侧。定位后用18G皮肤穿刺针头分别在L5～6椎间盘（兔的腰椎数为7节）进行穿刺。深度控制在5mm，刺入后维持5秒。

2.2 分组与给药 造模后将大白兔随机分为三个实验组，每组24只，术后第2天开始，分别采用芍药苷低剂量［30mg／（kg·d）］、高剂量［120mg／（kg·d）］及等量生理盐水灌胃治疗，另取新西兰健康大白兔24只设为正常对照组，采用等量生理盐水灌胃，分笼常规饲养，温度18～22℃，湿度50%～60%。

2.3 指标检测 分别在术后的3周、6周和10周将各组大白兔处死取材，每时间段每组各8只，离断腰椎，分离椎间盘。组织在石蜡切片机上切片，片厚3～4μm。组织片在展片机上展开后，贴于预先涂布10%多聚赖氨酸的载玻片上，贴好的切片在烤片机上63℃烘烤8小时，以利于组织牢固地贴在载玻片上。贴片经上述处理后，室温防尘保存待染色。免疫组化检测治疗前后椎间盘组织中FasL、IL－1β及TNF－α的表达。

2.4 结果判断 光镜下观察髓核组织变化情况。免疫组化染色阳性物定位于细胞浆，呈棕黄色。所得结果由两名病理科医师计数10个高倍镜（× 400）下的细胞总数及阳性细胞数，取平均值，求出阳性细胞的百分比。

2.5 统计学处理 采用SPSS17.0统计学软件计量资料采用t检验。

3 结 果

3.1 FasL的阳性表达 3、6、10周时，各造模组的FasL表达均高于正常对照组（均P＜0.01）。高、低剂量组的FasL表达均低于生理盐水组（均P＜0.05），而高、低剂量组间差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表1。

表1 芍药苷对IDD兔髓核细胞FasL表达的影响（±s）

表1 芍药苷对IDD兔髓核细胞FasL表达的影响（±s）

与正常对照组比较**P＜0.01，与生理盐水组比较△P＜0.05

细胞阳性率组 别n（%）3周6周10周正常对照组87.993±1.439 8.170±1.175 7.925±1.411生理盐水组835.154±7.441**36.463±5.836**45.405±5.014**低剂量组831.283±6.128**△34.230±2.016**△39.760±4.290**△高剂量组833.358±5.185**△30.985±3.120**△38.688±3.312**△

3.2 TNF－α的表达 3、6、10周时，各造模组的TNF－α表达均高于正常对照组（均P＜0.01）。3周时，高、低剂量组与生理盐水组差异无统计学意义（P＞0.05）；6、10周时，高、低剂量组的TNF－α细胞阳性率均低于生理盐水组（P＜0.05），而3、6、10周时，高、低剂量组间差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表2。

表2 芍药苷对IDD兔髓核细胞TNF－α表达的影响（±s）

表2 芍药苷对IDD兔髓核细胞TNF－α表达的影响（±s）

与正常对照组比较**P＜0.01，与生理盐水组比较△P＜0.05

细胞阳性率组 别n（%）3周6周10周正常对照组85.784±2.3484.936±1.0875.291±1.428生理盐水组861.979±8.197**67.244±7.405**71.224±10.972**低剂量组863.334±10.442**56.210±13.173**△53.012±13.772**△高剂量组862.980±12.463**53.437±13.041**△51.136±12.961**△

3.3 IL－1β的表达 3、6、10周时，各造模组的IL－1β表达均高于正常对照组（均P＜0.01）。3、6、10周时，高、低剂量组的IL－1β细胞阳性率均低于生理盐水组（均P＜0.05），而高、低剂量组间差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表3。

表3 芍药苷对IDD兔髓核细胞IL－1β表达的影响（±s）

表3 芍药苷对IDD兔髓核细胞IL－1β表达的影响（±s）

与正常对照组比较**P＜0.01，与生理盐水组比较△P＜0.05

组 别n（%）3周6周10周细胞阳性率正常对照组84.589±1.9855.336±2.1525.457±2.038生理盐水组872.080±12.272**75.433±11.356**76.876±9.879**低剂量组865.528±9.431**△57.210±12.586**△52.912±9.317**△高剂量组866.331±11.986**△59.471±11.749**△50.011±13.168**△

4 讨 论

IDD是椎间盘内的病理改变，而椎间盘的外形没有或仅有极小的改变，是椎间盘退变的主要过程。椎间盘退变是腰椎退行性疾病的一个重要始动因素［1－2］，诸如腰椎管狭窄、腰椎间盘突出、腰椎退行性滑脱、不稳等。椎间盘是人体内最大的无血管组织，髓核被内外层纤维环及上下软骨终板紧密包绕，与机体的免疫系统相隔绝。所以当髓核因各种原因与机体免疫系统相接触时，就会引发自身的免疫炎性反应［3－4］。如何能够抑制这种免疫炎性反应，延缓椎间退变是现今椎间盘退变性疾病的研究重点。

本文研究发现，纤维环穿刺法不会造成髓核组织的丢失，而且本实验中HE染色提示正常髓核组织中有着大量的髓核细胞，到了造模后的第3、6周髓核细胞则不断减少，到第10周时髓核中主要为纤维软骨组织残留。证实了通过纤维环穿刺可以诱导大白兔椎间盘退变，而且这种退变是一个缓慢渐进的过程，能够较好地模拟人类椎间盘退变［5］。

退变的椎间盘内炎症介质的含量非常高，炎症介质作用于窦椎神经末端的伤害感受器可直接导致电生理变化，或使其极其敏感，在轻微的机械压力刺激下也可产生神经冲动。诸如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素－1（IL－1）及前列腺素（PGE2）等炎症介质在盘源性腰痛中发挥着重要的作用［6－7］。

在正常髓核中FasL与椎间盘免疫豁免机制有关，而髓核组织的免疫豁免效应是由生理学屏障与FasL共同维持的，当这一屏障受损时，髓核组织会与机体免疫系统接触，FasL表达水平升高，髓核细胞凋亡增加，激发炎症反应。在前期的研究中作者成功构建了兔IDD模型，并且发现正常与退变的兔髓核组织中均存在着FasL的表达，而且纤维环破裂会明显上调FasL表达水平，髓核细胞凋亡增加［8］。FasL是一个具有多重效应的细胞因子，除了免疫豁免外，FasL还具有促进炎症反应的作用。当椎间盘生理解剖学屏障受到损伤时，FasL与IL－6及TNF－α的表达程度增强，FasL所介导的免疫炎性反应可能是引起椎间盘退变的一个重要机制［9］。

中医认为，盘源性腰痛在祖国医学属于“痹症”的范畴，主要因“气滞血瘀、不通则痛”所致，治疗上应以活血化瘀、理气止痛为主。赤芍具有活血化瘀功效，白芍具有抗炎止痛等作用，临床治疗腰痛的中药方剂中，有不少含有赤芍、白芍成份。陈尹等［10］发现，白芍总苷可以明显抑制佐剂性关节炎大鼠膝关节巨噬细胞样滑膜细胞的IL－1分泌，并且抑制成纤维样滑膜细胞内MAPK信号通路中ERK等的磷酸化、减弱成纤维样滑膜细胞的增殖。

本文通过穿刺法构建了兔IDD模型，经芍药苷灌胃治疗，结果发现经过芍药苷干预后，在造模后的3、6、10周，FasL、IL－1β及TNF－α的阳性表达率明显低于未经芍药苷干预的组别。可见芍药苷可以抑制FasL表达，进而抑制IL－6及TNF－α等炎性因子的分泌，为临床采用芍药苷治疗IDD提供了实验依据。但本组实验未发现高、低剂量组之间存在差异，是否与兔机体无法吸收过高浓度有关，需要通过血清药理学及细胞学实验进一步证实。

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［4］ Satoh K，Konno S，Nishiyama K，et al．Presence and distribution of antigen－antibody complexes in the herniated nucleus pulposus．Spine，1999，24（19）：1980

［5］ 王靖，唐天驷，姚啸生，等．纤维环穿刺诱导椎间盘退变动物模型的实验研究．中国脊柱脊髓杂志，2006，16（4）：284

［6］ Kato T，Haro H，Komon H，et al．Sequential dynamics of inflammatory cytokine，angiogensis inducing factor and matrix degrading enzymes during spontaneous resportion of the heriated disc．Orthop Research，2004，22（4）：885

［7］ Ariga K，Miyamoto S，Nakase T，et al．The relationship between apoptosis of enoplate chondrocytes and aging and degeneration of the intervertebral disc．Spine，2001，26（22）：2414

［8］ Wang J，Tang T S，Yang H L，et al．The expression of Fas ligand on normal and stabbed－disc cells in a rabbit model of intervertebral disc degeneration：a possible pathogenesis．J Neurosurg Spine，2007，6（5）：425

［9］ 王靖，唐天驷，滕红林，等．FasL在家兔退变髓核组织中的表达及其与白细胞介素－6和肿瘤坏死因子的相关性．中华实验外科杂志，2010，27（1）：114

［10］ 陈尹，魏伟，吴虹，等．芍药苷对佐剂性关节炎大鼠脾细胞产生抗体和cAMP水平的影响．药学学报，2007，42（11）：1147

1．国家自然科学基金（081202711）

2．浙江省自然科学基金（LY12H06004）

3．浙江省中医药科学研究基金（2010ZA083）