胰腺癌干细胞的研究现状和若干进展

程明荣　张智平

摘 要 胰腺癌在消化道肿瘤中预后最差，化疗极易耐药，导致胰腺癌治疗失败的原因可能与胰腺癌干细胞有关。本文通过文献复习，对胰腺癌干细胞的发现、分离、鉴定、信号转导通路和靶向胰腺癌干细胞给药系统的研究进行综述，尤其是胰腺癌干细胞靶向给药系统取得的较大进展，为临床胰腺癌的治疗带来新的希望。

关键词 肿瘤干细胞 靶向给药系统 耐药 信号转导通路 胰腺癌

中图分类号：R735.9 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2014）06-0028-06

胰腺癌是目前预后最差的消化道肿瘤，其发病率与死亡率接近。虽然，胰腺癌的研究取得了重要进展，但其预后仍很差，学者们仍在寻找新的治疗方法。肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）学说的提出为寻找根治胰腺癌提供了新的理论基础，该学说认为，在实体瘤或体外细胞系中存在的极少数细胞具有自我更新和多分化潜能，可能在肿瘤的发生发展以及放、化疗耐药中起到重要作用[1]。目前，胰腺癌干细胞已被证实具有自我更新、高致瘤性、活跃分化潜能和强耐药性的特点，具有极高的恶性特点。

1 CSC的理论基础

肿瘤由具有异质性的组织组成，关于肿瘤的异质性有两种解释：一种观点认为异质性起源于不同类型的细胞，即具有干细胞样特性的细胞，这种细胞来源于天然多功能干细胞，还是正常细胞经过突变后转变为干细胞，尚不清楚；另一种观点认为，肿瘤的异质性来自克隆演化，突变的肿瘤细胞生存并繁殖，突变优势细胞群类似干细胞，具有促进肿瘤生长的能力。两种观点并非相互独立，而是具有内在联系。因此，CSC具有两层含义[2-3]：①肿瘤起源于组织干细胞或胚胎细胞，具有自我更新的调节；②肿瘤是具有干细胞特性的细胞亚群。

2 CSC的简要发展史

早在150年前，病理学家Connnheim和Duramte就提出，组织中存在的极少数干细胞可能是肿瘤的起始细胞。1994年，Lapidot等[4]首次通过特异细胞表面标志分离出人急性粒细胞白血病干细胞，发现只有白血病干细胞才具有不断自我更新，维持其恶性显性的作用，首次证明了CSC的客观存在，是人类第一次分离出CSC。2003年，Al-Hajj等[5]成功分离出人类乳腺癌干细胞，通过连续移植实验，诱发出非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷性小鼠（NOD/SCID）的乳腺癌。2004年从中枢神经系统肿瘤中分离出具有干细胞特性的细胞[6-7]，并在动物实验中得到验证。2005年，Saad等[8]从前列腺癌组织中成功分离出表型为CD44+/α2β1hi/CD133+的前列腺癌干细胞（约0.1%），其在体外有很高的增殖潜能并形成二次克隆，具有自我更新、无限增殖和分化的能力，在非雄激素依赖下长期存活。2005年Kim等[9]从小鼠非小细胞肺癌模型的最初阶段分离到支气管肺泡干细胞。2007年Li等[10]首次从手术切除标本中分离到CD44+CD24+ESA+胰腺癌干细胞，并通过小鼠的体内成瘤实验证明其成瘤性，组织病理学特点与手术标本类似，证实该干细胞具有高度的自我更新能力。

3 CSC的鉴定方法

目前鉴定胰腺癌干细胞的方法主要有细胞表面标记、侧群细胞（side populations，SP）实验、成球生长实验和动物致瘤性实验。

3.1 细胞表面标志

主要利用细胞表面带有特异性膜蛋白（即表面标志）的特点，经特异性抗体结合后，用流式细胞仪在荧光活化系统检测下分选出荧光细胞。胰腺癌表面主要分子标志为CD44+CD24+ESA+、CD133+、乙醛脱氢酶1（ALDH1）、c-Met等。Olempska等[11]应用实时定量PCR检测发现，ATP 结合盒（ATP-binding cassette， ABC）G2在细胞株Panel、Panc89、Colo-357、Panc Tul和A818-6中均显著高表达，而CD133仅高表达于Pane Tul和A818-6细胞株，因此认为ABCG2+/CD133+细胞可能是胰腺癌干细胞，并且通过致瘤实验得到验证[12]。Jimeno等[13]在动物实验中发现胰腺癌部分细胞高表达ALDH1，并且该细胞具有明显的耐药性，表现为CSC的特性。Li等[14]研究表明c-Met介导了胰腺癌干细胞的生长与转移，可作为一种表面标志进行肿瘤细胞的分选。

3.2 SP细胞实验

CSC具有ABC转运蛋白的功能，能够外排核酸染料Hoechst33342，而大部分非CSC不具备该蛋白。SP细胞实验利用该特性，通过荧光显微镜和流式细胞技术观察具有CSC特性的不着色细胞。Zhou等[15]分离出人胰腺癌细胞株panc-1中的SP细胞，并发现用吉西他滨处理后，SP细胞的比例明显升高，并且该SP细胞具有较高的克隆形成能力和更强的成瘤能力。

3.3 成球生长实验

CSC在特定的培养基可以形成干细胞球，从而特异富集CSC。其针对流式细胞分选出来的CSC的验证，将分选出的CSC进行体外培养，通过悬浮细胞球的生长验证CSC的自我更新和分化能力。细胞生长曲线实验是对分选出的CSC进行体外培养，观察细胞生长指数，并绘制生长曲线，通过对比普通肿瘤细胞的生长速度验证CSC的增殖能力。

3.4 动物致瘤性的体内实验

是指用一定数量的待测肿瘤细胞悬液接种至NOD/SCID小鼠体内，观察是否会有肿瘤生成以及肿瘤的发展进程，用以评估待测细胞是否具有形成并维持肿瘤生长及异质性的能力。动物体内致瘤性实验是目前验证CSC的金标准。

4 胰腺癌干细胞的通路研究

胰腺癌干细胞与正常细胞一样具有多分化潜能、自我更新能力和信号转导通路，这些通路在胰腺癌干细胞的自我更新和自我调控中起到重要作用。在胰腺癌干细胞中表现得异常激活的通路有音猬因子（sonic hedgehog， Shh）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Notch、骨形态发生蛋白（BMP）、胰十二指肠同源蛋白1（PDX1）和B细胞特异性莫洛尼白血病毒插入位点-1（B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site-1， BMI-1）等。

4.1 Shh通路

在人胰腺癌组织中的Shh通路异常激活，胰腺干细胞Shh通路的激活程度是胰腺癌组织的11倍[10]，并且发现利用转基因技术将Shh基因导入到正常胰腺中，可使胰腺组织向胰腺癌前病变方向发展，出现胰腺常见的基因突变类型，如K-ras基因突变、Her2/neu过表达等[16]，利用Shh通路抑制剂环巴胺抑制后，体外胰腺细胞增值明显抑制[17]。

4.2 BMI-1通路

原癌基因BMI-1是转录抑制因子基因polycomb家族成员，它通过调节端粒酶的活性控制细胞的增殖和凋亡。参与正常干细胞调控作用的BMI-1在CSC的维持和自我更新中同样具有重要作用，如乳腺癌、结肠癌等肿瘤中的CSC均明显上调。有学者证实胰腺癌细胞（CD44+CD24+ESA+）中的BMI-1 mRNA具有异常表达，并认为在胰腺癌干细胞中的自我更新的维持上具有重要作用[18]。

4.3 Notch信号通路

Notch是非常保守的信号系统，其受体多与相邻细胞间的膜结合配体结合而被激活。Notch途径的激活过程是γ-分泌酶作用于Notch受体的细胞内结构域，该结构域从膜上脱落，移位到细胞核调控基因表达，从而影响细胞增值、分化和转移过程。Notch通路的异常与胰腺癌干细胞的自稳具有明显的相关性[19]，其确切关系仍在进一步的研究中。

4.4 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路

mTOR信号通路是新近发现的胞内信号通路，该通路可汇聚和整合来自营养、生长因子、能量和环境压力对细胞的刺激信号，进而通过下游效应器真核细胞始动因子4E结合蛋白1（4EBP1）和核糖体S6蛋白激酶（S6KS）调节细胞生长，并发现该通路与胰腺癌干细胞的自我增值具有明显的相关性。Mueller等[20]发现，胰腺癌干细胞的mTOR信号通道异常活跃，雷帕霉素是mTOR的抑制物，阻断该信号通道可以抑制部分胰腺癌干细胞（CD133+）的生长，为了更好地杀灭干细胞，研究人员将雷帕霉素、环杷明和吉西他滨三药联合（CRG），发现对CSC的杀伤力极强，可以明显延长无瘤生存时间，提示mTOR信号通路积极参与了胰腺癌干细胞的自我更新与分化。

4.5 PDX1途径

PDX1是胰腺发育早期起重要作用的启动基因表达的蛋白，在胰腺自我更新时，PDX1可在胰腺导管细胞中短暂表达，在胰腺导管腺癌中高表达[21-22]，其表达程度又与肿瘤的大小、分化程度以及淋巴结转移等密切相关。并且发现这些特性都与CD133+，CXCR4+的胰腺癌CSC的特性非常吻合[23-24]。

4.6 基质细胞衍生因子1/侵袭前端趋化因子受体-4（SDF-1/CXCR4）轴

SDF-1/CXCR4轴无论是胚胎时期胰腺的形成还是损伤胰腺的修复均具有重要作用，可以促进细胞的增殖和迁移并促进胰管形成。有研究表明在胰腺癌CSC发生转移之前，使用特异性抑制剂（AMD-3100或AMD-070）阻断CXCR4的表达，会明显降低胰腺癌的转移发生率[25- 26]。

5 胰腺癌干细胞与转移

胰腺癌一旦出现转移，预后极其不佳，癌细胞的转移过程涉及多种活性因子及酶的参与，并不是所有的胰腺癌细胞都具备转移的能力，只有其中的一小部分会出现转移并最终形成转移瘤。Wellner等[27]研究发现，锌指E-盒结合同源异形盒1（ZEB1）是胰腺癌细胞上皮间质转化的激活因子，ZEB1通过抑制细胞microRNA-200的表达，阻止细胞的正常分化，激活细胞出现上皮间质转化，并使癌细胞具备干细胞的表型，从而使癌细胞发生侵袭、转移。因此提出ZEB1-microRNA-200反馈弧可以作为治疗胰腺癌的靶点。Hermann等[28]发现侵袭性胰腺癌标本中，CD133胰腺癌干细胞与CXCR4+呈共表达。CD133+CXCR4+细胞和CD133+CXCR4-细胞均可在小鼠体内形成肿瘤，但是仅CD133+CXCR4+细胞的肿瘤发生转移，提示可能存在两种不同表型的胰腺癌干细胞，即稳定型干细胞和游走型干细胞；同时发现在小鼠模型中阻断CXCR4胰腺癌干细胞与化疗耐药信号通路可抑制肿瘤转移，这对临床治疗胰腺癌转移有重要的指导意义。但目前仍未明确CXCR4+细胞来源于何处，是干细胞最初就富有的一种亚克隆，还是在肿瘤发展过程中干细胞受到微环境影响诱导产生的新亚型，因为这涉及如何确定通过抑制CXCR4+胰腺癌干细胞来阻止肿瘤转移的治疗策略，究竟是直接消灭CXCR4+的干细胞亚群，还是诱导干细胞分化进而减少干细胞抑制转移。Singh等[29]使用吉西他滨联合AMD3100封闭胰腺癌细胞CXCR4后，发现胰腺癌细胞的生长与转移都受到了抑制，很好的验证了Hermann的研究成果。

6 胰腺癌干细胞与耐药性

耐药的肿瘤细胞与CSC具有许多相似的特征，如大多处于细胞周期的G0期，不进入增殖周期，而大部分化疗药物作用于细胞增殖期，不能杀灭处于G0期的癌细胞，这些细胞的细胞膜ATP泵耐药分子，具有极强的自我修复DNA损伤和抗凋亡的能力。越来越多的研究显示胰腺癌干细胞介导了其对放化疗的抵抗，Hermann等[30]采用吉西他滨干预CD133+CSC，发现其对吉西他滨明显耐药，干预5 d后其比例明显上升，达细胞总数的50%。他们在体内实验发现吉西他滨具有抑制胰腺癌生长的作用，但CD133+CSC的比例明显升高，进一步说明CD133+CSC的耐药性。Wang等[31]的研究支持Hermann的研究结果。Lee等[18]通过CD44+CD24+ESA+CSC移植瘤模型也证实胰腺癌干细胞对放、化疗抵抗。他们用放疗联合吉西他滨化疗干预上述模型时发现，移植瘤的生长不仅不被抑制反受到刺激，深入研究表明CD44+CD24+ESA+CSC在吉西他滨的作用下不会凋亡，仅停止增殖，一旦停止用药，该细胞亚群又开始增殖和分化。Kallifatidis等[32]的研究发现，西兰花提取物莱菔硫烷（sulforaphane，SFN）能增强化疗药物对胰腺癌CSC的杀伤作用，体外实验发现，通过抑制ALDH1和Notch-1表达可诱导凋亡和抑制细胞的增殖；体内实验发现，SFN可以抑制种植瘤在裸鼠体内生长，且无不良反应。Rausch等[33]研究发现，肿瘤靶向药物索拉非尼（Sorafenib）可以抑制胰腺癌CSC的增殖、分化和转移，在种植瘤模型研究中，发现索拉非尼可以抑制种植瘤的生长和血管形成，但却可以激活胰腺癌CSC中的核因子-κB（NF-κB），NF-κB是一种常见的转录因子，可以被炎性因子、生长因子或趋化因子等激活，NF-κB一旦被激活，就会使胰腺癌CSC死灰复燃，而将SFN与索拉非尼联用，可以阻止NF-κB的激活，抑制癌细胞克隆增殖，彻底消灭胰腺癌CSC。

7 胰腺干细胞的临床意义

肿瘤现有的药物治疗，虽然具有一定的疗效，对肿瘤细胞具有明显的抑制和控制作用，无论对转移灶和原发灶，均是暂时的控制，大多数患者均可以发生复发和转移，其中最为关键的问题是没有彻底清除CSC。因此，消灭非成瘤细胞，可以使肿瘤缩小，但不能治愈，如果药物直接针对CSC，直接将CSC进行清除和诱导CSC进行转化，将对肿瘤的治疗是一个历史性的改变。因此针对胰腺癌干细胞的信号转导通路的研究，会导致新的治疗肿瘤方法的诞生。Mueller等[20]报道应用CRG三联疗法治疗胰腺癌干细胞具有明显的疗效，但仍有一定的临床风险，如雷帕霉素和环杷明联用传统化疗药有潜在的风险，可能对其他器官的功能同样具有抑制作用。当然Mueller等[20]的CRG三联疗法在动物实验中显示裸鼠尚能耐受该疗法，但应用于临床还需大量的临床前实验。虽然此疗法未进入临床，但其优势尚存，CRG三联疗法中的药物均已经在临床使用，可以减少巨大的工作量，而且各自的毒副作用已知，仅需研究联合应用后的毒副作用，相对工作量减轻。

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（收稿日期：2014-01-07）