黄酮类化合物对学习记忆障碍动物模型的研究进展Research progress of flavonoids compounds on dysfunction of learning and memory

姚 祯，范红艳 (吉林医药学院：.200级药学本科班,2.基础医学院药理教研室，吉林 吉林 3203)

随着人类物质文明和生活水平的不断提高，人的寿命普遍延长，与此同时老年人的学习记忆功能也逐渐衰退。引起学习记忆障碍的疾病主要有阿尔茨海默病，其次有血管性痴呆，最后还有抑郁症相关疾病等。阿尔茨海默病是一种中枢神经系统退行性疾病，亦称老年性痴呆。阿尔茨海默病发病率在65岁人群为5%，在95岁人群则高达90%以上，我国65岁以上老人的患病率为4%左右，阿尔茨海默病已经成为继心血管疾病和癌症之后威胁人类健康的第三大疾病。血管性痴呆是指脑血管疾病如脑梗塞、低灌注或出血所致的脑血管供血障碍引起的认知功能损害综合征。

1 学习记忆障碍动物模型的建立方法

虽然学习记忆障碍的确切发病机制仍不清楚，但引起学习记忆障碍的常见病-阿尔茨海默病的发病机制研究较多，常认为与神经递质紊乱、基因突变、自由基损伤、神经细胞凋亡、淀粉样蛋白沉积和 tau蛋白异常磷酸化等有关[1]。相关的国内外常用的学习记忆障碍动物模型建立方法有：D-半乳糖诱导型，东莨菪碱诱导型，β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)诱导型，糖皮质激素诱导型，脂多糖诱导型，慢性脑缺血诱导型，慢性铝中毒诱导型。

D-半乳糖诱导学习记忆障碍动物模型的机制是：一方面，D-半乳糖被还原成半乳糖醇，在细胞内堆积使渗透压升高，使细胞肿胀、代谢紊乱，诱发衰老[2]；另一方面，D-半乳糖在其氧化酶的作用下，产生大量自由基，加快衰老[3]。

东莨菪碱诱导学习记忆障碍动物模型与东莨菪碱导致海马脑区的长时程增强诱导障碍有关[4]，乙酰胆碱是与学习记忆关系密切的神经递质，东莨菪碱作为非选择性 M 受体拮抗剂，其可以阻碍乙酰胆碱的传递和发挥作用。

Aβ分子之间以β相互聚集折叠形成纤维，不易被蛋白酶降解而形成老年斑。“β-淀粉样蛋白级联假说”认为脑内过量的Aβ沉积会引发神经元细胞变性，形成老年斑，炎性反应，氧化应激，tau蛋白高度磷酸化形成神经元纤维缠结，并最终导致细胞死亡[5]。此学说为Aβ诱导学习记忆动物模型奠定了基础。

长期应用糖皮质激素(GC)使血中GC水平升高，凋亡有关基因AIG-2蛋白表达增加，激活受体和电压依赖性Ca2+通道，促进胞外 Ca2+内流，导致神经细胞内Ca2+超载。胞浆Ca2+升高引起神经细胞凋亡，导致学习记忆能力下降[6]。

脂多糖是一种细菌外膜的非感染性的成分，也是小神经胶质细胞的有效刺激物，可以产生脑中前炎性细胞活素[7]。因为细胞因子受体高密度分散在整个脑的海马中，所以神经炎症和神经变性的紊乱和持久增长的促炎性细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)在中枢神经系统中损伤与海马组织相关的学习记忆功能[8-9]。

慢性脑缺血模型是通过手术结扎双侧颈总动脉等手段使脑长期、慢性的供血不足，而最终导致脑出现进行性或持久性神经功能障碍和认知减退的表现[10]。

铝中毒诱导的学习记忆障碍模型主要是铝能降低动物海马蛋白激酶(PKC)和有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的活性，减少胞外信号调节激酶(ERK1/2)和钙离子-钙调素依赖的蛋白激酶(CaMKⅡ)的表达从而阻断了与学习记忆有关的信号通路[11]。另外，铝中毒还可以使兴奋性谷氨酸和谷氨酰胺含量明显增加，伴随GABA含量的下降，暗示铝在兴奋性谷氨酸介导的神经毒性方面起了一定作用[12]。

2 黄酮类化合物对学习记忆障碍动物模型的研究

2.1 抗Aβ毒性的黄酮类化合物

淀粉样蛋白前体(amyloid precursor protein，APP)基因突变与Aβ的形成密切相关，在早发性家族性阿尔茨海默病中，在APP跨膜区内，异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸等疏水性氨基酸替代APP717位撷氨酸，与Aβ羧基端仅隔4个氨基酸，促进APP分解，脑实质进行性堆积不溶解的Aβ沉积增加形成弥散斑块，导致阿尔茨海默病的发生[13]。楚晋等[14]观察淫羊藿黄酮对转基因小鼠学习记忆功能和脑内APP、β位点淀粉样蛋白前体裂解酶(β site APP-cleaving enzymes，BACE)的表达及Aβ生成及含量的影响，应用Morris水迷宫和物体识别方法测试小鼠学习记忆能力，应用免疫组化学及Western Blot方法分别检测海马CA1区及皮层中APP、BACE的表达，采用双抗体夹心ELISA试剂盒测定海马中不溶性β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)含量。结果表明,淫羊藿黄酮(0.03 g/kg，0.1g/kg)能够通过降低APP转基因小鼠脑内APP和BACE的表达,来减少Aβ的产生和聚集，从而延缓APP转基因小鼠大脑病理进程。

2.2 抗氧化的黄酮类化合物

细胞代谢过程中不断产生的自由基是人类衰老的重要因素。自由基对核酸和蛋白质有直接的氧化破坏作用，导致DNA突变，蛋白质分子结构改变等，严重影响遗传信息的转录、翻译，致使蛋白质合成减少，而蛋白质合成减少是老年性记忆力减退、认知障碍的主要原因之一。王瑞婷等[15]采用双侧海马各注射 Aβ25-355 μL(2 μg/μL)建立学习记忆障碍大鼠模型，Morris 水迷宫检测行为记忆能力，HE 染色观察大鼠海马 CA1 区神经元形态，检测海马组织中丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量。发现黄芩茎叶总黄酮(100、50mg/kg)可对抗Aβ引起的神经元损伤、提高学习能力，作用机制可能与其清除自由基，提高抗氧化酶活性，减轻 ROS对细胞的损伤有关。罗军等[16]每天给予大鼠200 mW/cm2的微波辐射，每天5 min持续一周，40 mg/kg的山楂黄酮灌胃14 d，采用Morris水迷宫检测大鼠学习与记忆能力的变化，采用光学显微镜观察脑组织结构的变化。结果显示山楂黄酮具有修复辐射损伤大鼠记忆，抑制羟自由基能力，提高SOD活力，增强辐射大鼠的总抗氧化能力和抗超氧阴离子活力。李志安[17]采用侧脑室注射Aβ1-42联合腹腔注射D-半乳糖构建大鼠衰老模型，并同时给予枫叶黄酮预防性治疗，发现枫叶黄酮能通过上调衰老模型大鼠大脑皮质组织中抗氧化物(酶) 谷胱甘肽还原酶(GR)、GSH-PX的含量，抗氧化应激损伤，抑制P38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的激活，增强细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)激活，改善空间探索学习记忆能力。

以下研究均采用D-半乳糖建立学习记忆障碍模型，通过Morris水迷宫、Y型迷宫、跳台实验进行学习记忆能力检测。邵盈盈等[18]发现紫心甘薯总黄酮(100、200 mg/kg)能有效改善学习记忆能力，抵抗衰老，机制可能是其通过提高机体内SOD和GSH-PX等抗氧化酶的活力有关，使清除自由基和活性氧的能力增强，从而减少自由基对细胞的损伤，同时减少MDA等代谢产物有效延缓小鼠衰老体征的出现和学习记忆能力的下降。王爱梅等[19]研究表明葛根异黄酮(80、160 mg/kg)对大鼠空间方位记忆能力有一定的影响，对衰老模型大鼠学习记忆功能具有促进作用，其作用机制可能与抗自由基损伤作用和降低乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性有关。张片红等[20]发现杭白菊总黄酮(100、150 mg/kg)对小鼠的学习记忆有明显改善，说明其对抗D-半乳糖诱发的衰老的发生可能是通过清除氧自由基和抗氧化特性来实现提高中枢胆碱能系统功能的作用。王浩等[21]研究发现，蜂胶总黄酮(30、60、90 mg/kg)通过阻断自由基链反应的各个环节，从而对抗自由基对中枢神经系统的损伤，有效改善D-半乳糖诱导的学习记忆障碍。李利平等[22]研究发现10 mg/kg银杏黄酮治疗可明显改善D-半乳糖所致衰老小鼠学习记忆能力，其机制可能与增强脑组织乙酰胆碱及单胺类递质活性，清除自由基，抗脂质过氧化等作用有关。

2.3 提高胆碱乙酰转移酶的黄酮类化合物

胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性降低和AChE活性明显升高，造成乙酰胆碱(ACh)的合成、储存和释放减少，皮质 ACh 受体数目减少，导致学习记忆减退和认知障碍[23]。 ChAT在胆碱能神经元细胞内合成，与ACh的分布几乎平行，故常作为研究胆碱能神经元的标志或估计 Ach含量的间接指标[24]。ACh是一种神经信息传导递质，脑记忆功能主要取决于脑组织内ACh的含量。当脑内ACh的含量高时，记忆脑区神经传导的功能与速度都会提高，记忆能力也会增强。反之，ACh含量降低时，会出现学习记忆障碍。孙晶等[25]用大鼠双侧海马CA1区注射Aβ25-35制备模型，Morris水迷宫实验观察大鼠学习记忆能力，免疫组化方法检测大鼠海马ChAT的表达，研究结果显示240 mg/(kg·d)大豆异黄酮组海马内ChAT免疫阳性细胞数量增加，同时发现大鼠的空间记忆能力也明显增强，可知大豆异黄酮改善学习记忆能力可能与改善胆碱递质合成有关。王玉梅等[26]将雌性大鼠双侧颈总动脉永久结扎两个月制备慢性脑缺血记忆障碍模型，通过Morris 水迷宫检测大鼠学习记忆能力，免疫组化测定海马细胞中ChAT、神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS) 和内皮型一氧化氮合酶(eNOS) 蛋白表达等指标，研究发现黄芩茎叶黄酮可以显著缩短脑缺血模型组大鼠找到平台的游泳路程，增加脑组织中ChAT蛋白的表达，提高胆碱能神经元活性，改善记忆障碍。

2.4 抗神经细胞凋亡的黄酮类化合物

Bax是重要的促凋亡基因，其诱导凋亡与 Bax同源二聚体的形成有关，Bcl-2 蛋白的抑制凋亡作用则要结合Bax形成异源二聚体。Bcl-2/Bax组成一个平衡体系，Bcl-2/Bax 的比值决定细胞凋亡是否进行，Bcl-2表达过多则抑制细胞凋亡，Bax表达过多则加速细胞凋亡[27]。蒋淑君等[28]海马注射冈田酸建立AD模型组，采用Morris水迷宫实验检测行为学，免疫组织化学检测海马Bcl-2、Bax蛋白表达，结果表明淫羊藿总黄酮(200 mg/kg)可以通过调节Bcl-2、Bax蛋白表达来抑制细胞凋亡，改善AD大鼠模型的学习记忆能力。施学丽等[29]应用孤养加慢性不可预见性应激建立抑郁症大鼠模型，用 Morris水迷宫法测定大鼠学习记忆能力，免疫组织化法检测大鼠海马CA3区脑源性神经营养因子(BDNF) 及其受体酪氨酸激酶B(TrkB)表达。研究发现：合欢花总黄酮(100、50、25 mg/kg)促进海马BDNF 及其受体TrkB内源性表达，从而对海马神经元可塑性进行调节，保护海马神经元可能是其提高学习记忆的原因之一。

2.5 细胞外调节蛋白激酶活化作用的黄酮类化合物

最近研究发现通过NDMA(N-methyl-D-aspartate)受体的细胞外调节蛋白激酶是巩固学习记忆的必要条件。Akira Nakajima[30]的研究发现，川陈皮素(一种柑橘类的植物的类黄酮)能加强细胞外调节蛋白激酶在人工培养的小鼠海马神经和PC12细胞中的表达。用50 mg/kg的川陈皮素来治疗地卓西平诱导的记忆障碍小鼠，通过蛋白质印迹分析表明，川陈皮素翻转了地卓西平诱导的抑制细胞外调节蛋白激酶活化作用，与人工培育的小鼠海马神经细胞，以一种浓度依赖的方式修复地卓西平诱导细胞外调节蛋白激酶NDMA受体应激的磷酸化作用损伤。所以激活细胞外调节蛋白激酶，对改善NDMA受体机能减退引起的学习记忆缺陷有重大意义。

近年来，黄酮类化合物作为天然植物中的一种有效成分，以其广泛的生理活性，引起了世界各国研究、开发、利用的热潮。我国植物资源丰富，且几乎所有植物的花、叶、茎中都含有一定量的黄酮类化合物，但在其开发利用中还存在很多问题，限制了黄酮类化合物的进一步开发与利用，如黄酮类结构复杂，作用位点多，作用机理不明确，缺乏黄酮类毒理评价研究等。而黄酮类化合物可通过抗Aβ毒性、抗氧化、提高ChAT、抗神经细胞凋亡、ERK活化作用等机制改善学习记忆能力。今后需要加强黄酮类分子结构与活性关系的研究，对黄酮类化合物进行结构改造和优化，使其具有针对性和高效性，可见黄酮类化合物在开发改善学习记忆药物方面有重要的研究前景。

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