近5年寒凝血瘀证动物模型实验研究进展

朱成慧，孟向文，朴盛爱，刘华朋，李丹丹

(天津中医药大学针灸学院，天津 300193)

寒凝血瘀证是临床常见的中医证型之一，血瘀由寒邪入于血分而致，多因素体肾阳不足，寒邪内生，或因常处于寒湿环境损伤阳气，而致体内阳气不足，失其温煦、推动的作用。申松希等[1]根据寒则凝，凝则成瘀，故寒邪易致寒凝血瘀这一理论，探索了寒凝证模型的制备方法。历代中医文献对寒凝血瘀证都有较多的论述，如《素问·调经论》：“气血者喜温而恶寒，寒则泣(涩)而不行，温则消而去之。”《诸病源候论》：“寒则血结，温则血消。”近年来寒凝血瘀证的临床和实验研究得到了广泛关注，其中动物实验研究是探索寒凝血瘀证机理的一个主要途径，越来越受到广大医学工作者的关注，但目前尚无理想的动物模型平台，创建和完善稳定的、符合临床的寒凝血瘀证动物模型平台成为该证型研究的重点工作之一。笔者全面检索近5年研究寒凝血瘀证动物模型的相关文献，从实验动物选择、造模方法及评价指标、寒凝血瘀证疾病动物模型、不同方法对寒凝血瘀证模型的干预研究等几个方面进行总结分析。

1 实验动物的选择

如何建立证候动物模型，这一问题近年来一直受到人们关注与探索，实验动物的选择是能否成功建模的关键因素之一。目前用于建立寒凝血瘀证的实验动物主要是小鼠和大鼠，也有研究者复制了兔和小型猪的证候模型。

2 造模方法及评价指标

谷万里等[2]在寒凝血瘀证动物模型的研究述评中综述了近10年关于寒凝血瘀动物模型的报道，最后总结出寒凝血瘀证的造模方法可以分为局部冻伤法、全身冷冻法、风寒环境法、冰水浸泡法和冰水浸泡加药物法等5大类。周华妙等[3]进一步探索了寒凝血瘀证动物模型的制作方法，将BALB/C雌性小鼠采用肾上腺素皮下注射加冰浴法进行造模，对造模前后小鼠进行症状和体征的评价，测定耳温及血液流变学变化等，结果模型组小鼠出现寒战、蜷缩少动、爪尾部紫癜等症状，并且耳温下降，全血黏度增高，与空白对照组比较差异有统计学意义，建立了符合中医证候特点的寒凝血瘀证小鼠模型。还有研究者对以往造模方法进行了优化筛选，如谢波等[4]探讨不同冷冻时间对寒凝血瘀证动物模型建立的影响，将大鼠随机分为5组，即空白组、5 d组、10 d组、15 d组、20 d组，除空白组外，其余大鼠置于0 ℃冰水中15 min，1次/d，各组分别冷冻相应天数，造成寒凝血瘀模型，观察血常规、卵巢、子宫指数和血液流变指标，造模10 d和15 d可见大鼠出现凝血功能增强，并且15 d组血液流变学异常最明显，从而对寒凝血瘀证的造模时间进行了优化。吴锐等[5]选用健康新西兰种大白兔为实验对象，寒凝血瘀模型组动物每日浸泡在0～1 ℃冰水中，20 min/d，连续3周，每兔每日只限饲40 g的高脂高糖饲料，造模3周后模型组动物在身体表征、舌象、微循环、血液流变学参数等方面与造模前及对照组相比有显著改变，成功复制了寒凝血瘀证动物模型。

冯麟等[6]以中医基本理论为指导，将贵州小型猪用失血和冰冷刺激的方法造模，观察动物的体征变化，并检测血常规、血液流变学、凝血功能、微循环、超氧化物歧化酶(SOD)、血栓素B2(TXB2)和6-酮-前列环素F1α(6-KeTo-PGF1α),结果模型组动物与对照组动物比较，表现出明显的血瘀体征(如后肢、臀部红肿青紫，耳唇部青紫,舌青紫、紫暗,脉涩或结代)，检测结果页显示红细胞、血红蛋白减少，白细胞、血小板增加，血液黏度和红细胞压积增高，凝血酶原时间、凝血酶时间、激活部分凝血激酶时间延长，纤维蛋白原增加，超氧化物歧化酶和血栓素B2增加，6-酮-前列环素F1α稍增加，微循环障碍,脏器组织切片镜检结果表明，模型组动物肺脏、肝脏、心脏等水肿、出血、瘀血，成功复制了血虚寒凝血瘀证的动物模型。

寒凝血瘀证模型的评价指标因实验目的不同而各异，王永炎院士提出“证候表征模型”概念以及证候模型研究应该遵循的因—脉—证—治原则后，引起了学术界广泛关注，研究者都希望找到共同的客观化的评价指标。杜正彩等[7]研究开发出中医实验动物证候表征采集分析系统，对寒凝血瘀证模型大鼠的毛色、眼睛颜色、耳廓颜色、舌色与足爪等多项中医证候表征指标采集分析，并与检测的大鼠血液流变学指标与微循环指标进行对比分析，结果模型组大鼠与正常组大鼠在眼睛颜色、耳廓颜色、舌色与足爪颜色的三原色分量值比较差异有统计学意义，且与肉眼观察到的症状及其他病理指标反应的病证情况相一致，初步实现了中医实验动物证候表征某些望诊指标采集的数字化，分析自动化，达到了客观、科学的要求，且实用性好。

3 寒凝血瘀证疾病动物模型的建立

基于此证型动物模型的疾病主要有原发性痛经、慢性盆腔炎、消化性溃疡、心肌缺血等。卢阿娜等[8]将36只大鼠切除背部棕色脂肪7 d后，丙硫氧嘧啶连续灌胃42 d，术后21 d开始雌激素连续灌胃28 d，成功地建立了原发性痛经寒凝血瘀证的大鼠模型。叶秋香等[9]采用苯酚胶浆法叠加冰浴法建立了病证结合的寒凝血瘀证慢性盆腔炎大鼠模型。吴卓霖等[10]用改良寒冷暴露及吲哚辛法建立寒凝血瘀证型胃溃疡大鼠模型，并认为此方法建立的模型符合中医证候及消化性溃疡“病症结合”的特点。谷万里等[11]将大鼠置于(-5±1) ℃环境中连续3 h,然后再恢复(20±1) ℃室温，并给予垂体后叶素20 U/(kg·d)腹腔注射，每日1次，连续3 d，结果模型组大鼠出现寒战、蜷缩少动、爪尾部紫等症状；检测结果示血清FT3、FT4、TSH降低，血浆ET升高，NO降低,与正常组比较差异有统计学意义，给硝酸甘油治疗后上述情况明显改善，成功造成符合中医证侯特点的寒凝血瘀心肌缺血动物模型。

4 不同干预方法对寒凝血瘀证模型的实验研究

目前关于寒凝血瘀证干预方法的实验报道主要是活血化瘀药物和艾灸，通过对动物模型相关指标的影响来探讨其作用机制，尚未发现针刺及拔罐对寒凝血瘀证的实验报道。如孟宪生等[12]通过代谢组学研究方法，寻找大鼠寒凝证潜在的生物标志物，研究热性中药川芎对其潜在生物标志物的影响，探讨川芎治疗寒凝证的作用机制，根据寒凝证的临床表现，制造寒凝血瘀大鼠模型，利用UPLC/Q-TOFMSBPI离子流图谱，分别绘制空白组、血瘀模型组、川芎大小剂量给药组的血浆BPI离子流指纹图谱,对图谱中分子离子峰进行分析，通过Markerlynx软件进行色谱峰自动识别和峰匹配,采用主成分分析法(PCA)对不同组间的数据进行模式识别，从而找到寒凝血瘀证潜在生物标志物及药物的作用靶点，阐明其作用机制，认为热性药川芎对寒凝血瘀证大鼠的作用机制，可能是通过抑制使磷脂酰胆碱转化为花生四烯酸的磷脂酶A2，使血栓烷的合成水平降低，影响磷脂酰胆碱代谢途径，使血瘀症状减轻而发挥治疗作用的。又如陈思宇等[13]探讨艾灸治疗寒凝血瘀证模型大鼠的活血化瘀作用机制，将健康雄性SD大鼠用低温冷冻法建立大鼠寒凝血瘀证模型，并用艾灸进行治疗，治疗完成日上午腹主动脉取血，检测内皮素和一氧化氮含量，认为膈俞、血海的活血化瘀作用是通过降低ET、升高NO实现的，委中、丘墟的活血化瘀作用是通过降低ET实现的，表明艾灸膈俞、血海、委中、丘墟有活血化瘀作用。

5 讨论

寒凝血瘀证模型的实验动物主要是小鼠和大鼠，比较单一，近年来逐步扩展到兔和小型猪等相对大型动物，增加了该证型实验动物的多样性，促进了针刺、拔罐等干预方法实验研究的可行性，但兔与小型猪的模型尚不稳定，有待今后相关研究的反复验证。造模方法在以往的造模方法基础上有所改进，更加注重中医证候特点，并对造模时间等进行了优化，但尚无理想的动物模型平台，今后应针对实验目的进一步对造模方法和实验指标进行优化。寒凝血瘀证的机理研究由血液指标检测和图像采集逐步拓展到分子生物学领域和图像的量化分析，但相关指标不系统，机理研究尚不深入。张栋等[14]认为今后中医证候动物模型复制应以中医理论为核心，以辨证论治为基础，脏腑理论为依据，病因病机为准则。笔者认为中医证候研究不应局限于指标的改变，更应注重的是指标的生物学意义。目前寒凝血瘀证的干预方法局限于药物和艾灸，今后应建立稳定的寒凝血瘀模型平台，以开展针刺和拔罐等中医疗法的研究，将中医证候和临床实际相结合，进一步揭示寒凝血瘀证的机制，从而为寒凝血瘀证的临床治疗提供科学依据。

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[3]周华妙,郭勇.寒凝血瘀证小鼠动物模型的建立及评价[J].中国中医药科技,2010,17(1):1-2.

[4]谢波,邓海山,喻斌,等.寒凝血瘀证大鼠模型的优化筛选研究[J].南京中医药大学学报,2013,29(3):262-265.

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