椎间盘退变的基因治疗

马振江,丁 伟,张 凯,赵 杰

下腰痛是一种常见病、多发病，它影响人们的生活质量和精神状态，成为困扰人类的疾病之一[1-3]。很多因素都会导致下腰痛，其中椎间盘退变是最重要的因素之一[4]。目前临床上针对椎间盘退变引起相关疾病的治疗策略是解除椎间盘退变相关的脊髓、神经和血管刺激或压迫，并非针对椎间盘退变的病理过程，因而临床症状可反复发作，而且手术后病变节段的相邻节段椎间盘退变加速[5-6]。随着科学技术的发展，特别是分子生物学技术不断进步，延缓甚至逆转椎间盘退变正成为可能。目前治疗椎间盘退变的分子生物学技术主要包括三大类：细胞治疗、组织工程治疗及基因治疗。本综述主要着重基因治疗。

1 椎间盘退变的病理机制

椎间盘由髓核、纤维环和软骨终板构成，其主要成分是椎间盘细胞和细胞外基质。软骨终板由圆形软骨细胞组成。纤维环细胞分为3层，外层呈梭形，内层与软骨细胞相似，中间层则是移行带。髓核细胞在幼儿时主要由脊索细胞组成，成年时则逐渐被纤维软骨所取代。椎间盘细胞的密度较大多数组织细胞密度低，细胞分布也不均匀，细胞外基质主要由胶原、蛋白多糖和弹性蛋白组成。正常情况下纤维环中含有Ⅰ型胶原，主要是抗张力；髓核含有Ⅱ型胶原，主要是抗压力。蛋白多糖是椎间盘主要的大分子结构，包括硫酸软骨素、硫酸角质素和透明软骨素等，主要作用是维持椎间盘水分、浓度、渗透压、正常代谢和均匀分布应力。弹性蛋白与胶原纤维一样固定椎间盘，具有弹性，起震荡吸收作用。椎间盘是一封闭结构，内无血管，椎间盘细胞只能靠溶质弥散获取营养，这不利于损伤修复。但在封闭相对缺血的环境下却可避免发生自身免疫反应。这使得基因疗法的应用比其他组织更具优势。

到目前为止，椎间盘退变的确切机制尚不清楚，众多因素(包括遗传、生化和生物力学等)都可能引起椎间盘退变[7]。过去观念认为椎间盘退变主要与环境因素有关，比如司机驾车时震动[8]，举重运动员抓举重物[9]，缺少运动锻炼的生活方式[10]。此外吸烟或者创伤也被认为是重要因素之一[7-8]。但目前最新观点认为椎间盘退变过程中，遗传因素的作用占70%，而其他环境因素的作用只占30%[11]。椎间盘退变最主要的标志是蛋白多糖的进行性减少，这与氧张力降低、自由基增加、PH降低、蛋白溶解酶增加有关[11-12]。由于蛋白多糖的丢失，髓核不能保持正常的流体静力压，最终导致椎间盘脱水变性[13]。另外，椎间盘中胶原的比例也发生改变，Ⅱ型胶原逐渐减少。最终导致纤维环和髓核发生退变，进而影响椎间盘的生物力学特性[14-15]。

很多研究表明蛋白多糖的减少是分解代谢和合成代谢不平衡所致，原因在于基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和解聚素样金属蛋白酶表达上调，同时胶原和蛋白多糖的合成减少[16-17]。随着分子生物学的技术不断进步，基因治疗在改变椎间盘细胞代谢和生物力学性能方面发挥着重要作用。

2 基因治疗

基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿基因缺陷和异常以治疗相关疾病，也就是将外源基因通过基因转移技术插入患者适当的受体细胞中，通过外源基因制造的产物治疗某种疾病。具体到椎间盘的基因治疗，包括以下几部分：①充分明确椎间盘退变的机制；②目的基因的选择与修饰；③转基因载体的选择与应用；④转基因的调控。根据对靶细胞处理方法的不同分为2种：一是直接基因疗法；二是间接基因疗法。直接基因疗法操作比较简单，但是安全性较差，而间接基因疗法操作复杂，细胞特性容易发生改变，基因表达不一定满意，但是比较安全。Wehling等[18]1997年首次报道逆转录病毒作为载体携带β-半乳糖苷酶和白介素受体-1拮抗剂基因转染牛软骨细胞，48 h后尽管只有1%细胞被转染，但是白介素受体-1拮抗剂基因较对照组表达增加。这是首次提出应用间接基因疗法治疗椎间盘退变。基因转移至靶细胞一般有以下方法：①电穿孔法；②显微注射法；③粒子轰击法；④超声波法；⑤磷酸钙共沉淀法。

2.1 基因治疗载体

转基因载体是研究基因治疗中最重要和最艰难的部分之一。理想的基因载体具有以下特征：①容易进入靶细胞；②能够在靶细胞中持续高水平表达；③外源性基因含有自主复制的构件或整合于基因组活化区; ④操作比较安全；⑤容易大量生产[17]。基因载体分为两大类：一类是病毒载体，其转染效率高，基因表达水平高，持续性好，但是毒副作用大，安全性差，比如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、细小RNA病毒等；一类是非病毒载体，转染效率及表达水平不高，但是安全性较好，比如脂质体和DNA配体复合物。目前病毒载体是椎间盘细胞的首选载体，其中腺病毒、腺相关病毒、慢病毒载体应用较多，具体如下。

2.1.1 腺病毒载体

腺病毒为线性双链DNA，分为6个亚属，近50个亚型。目前主要用以构建载体的是2型和5型腺病毒，其能够转染分裂细胞和非分裂细胞，病毒基因并不整合到宿主细胞，所以其选择的范围很广。1998年Nishida等[19]首次应用腺病毒载体介导，将标记基因LacZ转染体内外兔椎间盘髓核细胞。体外实验发现基因LacZ全部表达，无明显细胞毒性，而且基因LacZ持续表达3周未减退。体内实验证明基因LacZ不仅局限在注射部位而且弥漫到周围椎间盘，持续稳定表达12周，组织学上未发现明显炎症改变。以上表明腺病毒载体转染椎间盘细胞是可行的。1999年Nishida等[20]再次报道应用腺病毒载体介导，将基因hTGF-T1转染体内的兔椎间盘髓核细胞,免疫组化提示转染的髓核细胞中hTGF-T1的表达比对照组增加5倍，同时蛋白多糖的含量增加了1倍。此实验进一步证明腺病毒载体转染椎间盘细胞是可行的。2000年Moon等[21]报道应用腺病毒载体介导，将基因LacZ和荧光素酶转染退变和未退变的椎间盘细胞，结果表明椎间盘细胞达到100%转染，需要的最小病毒量是150 mol,同时在退变和未退变的细胞中荧光素酶活性没有明显差异。此实验首次证实腺病毒载体转染人椎间盘细胞可行，为进一步治疗人椎间盘退变提供了一种途径。但是由于腺病毒载体不整合到宿主细胞，同时容易产生抗原，进一步导致应答反应，故其表达时间不是很长[22]。有学者使用腺病毒作为载体尝试转染牛髓核细胞，使其表达多种骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)和Sox9基因，此研究表明，经过BMP-2和BMP-7转染的牛髓核细胞能合成大量的多聚糖蛋白[23]。

2.1.2 腺相关病毒载体

腺相关病毒为线性单链DNA，无致病性，其基因组的整合对细胞的复制无任何不良影响，可以在19号染色体上进行定点特异整合，稳定性好，且能转染分裂细胞和非分裂细胞，但病毒小，最大插入列仅4.5 kb，而且不容易获得高滴度。Lattermann等[24]的一项实验，分别在体内、体外比较腺病毒和腺相关病毒载体转染髓核细胞的效率，腺相关病毒载体表达时间长达6周，而且目的基因LacZ表达水平也较高。尽管腺相关病毒有很多缺点，但目前仍受到很多关注

2.1.3 慢病毒

慢病毒是一种逆转录病毒，以人类免疫缺陷I型病毒(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)为基础发展起来的基因治疗载体，与一般的逆转录病毒载体不同，既能感染分裂细胞又能感染非分裂细胞，同时保留了整合到宿主染色体上的特点，可转移较大的基因片段、目的基因表达时间长、而且不易诱发宿主免疫反应[25]。

2.2 椎间盘细胞的相关基因

研究表明许多细胞因子与胶原、蛋白多糖有关。胶原和蛋白多糖随着时间的延长会逐渐失去弹性和张力，进而水含量减少，使得细胞外基质承受过度负荷，导致基质降解，椎间盘发生变形，生物力学性能发生改变，最终导致椎间盘退变。根据作用的不同将细胞因子分为4类：①抗分解代谢因子，如MMP抑制剂、白介素-1受体拮抗剂；②促细胞分裂因子，如胰岛素生长因子、生长分化因子；③骨诱导形成细胞因子，如骨形态发生蛋白；④细胞内调节因子，如软骨特异性基因Sox-9。典型因子具体如下。

2.2.1 抗分解代谢因子

MMP组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)家族目前发现有4种：TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4。其中TIMP1具有多种生物学功能，并且在细胞外基质改建和椎间盘病理过程中发挥生物学作用[26]。其主要是对MMP的抑制作用，并能促进细胞增殖抑制细胞凋亡[27]。Sobajima等[28]报道兔椎间盘退变早期TIMP1表达下降，3周后表达量约为退变前的10%，此研究表明早期可以向椎间盘注射TIMP1以延缓退变。Wallach等[29]报道腺病毒载体转染TIMP1基因和BMP-2基因，结果表明细胞外基质降解减少，同时TIMP1与BMP-2促进细胞合成代谢效果相当。

2.2.2 促细胞分裂因子

2.2.2.1 胰岛素生长因子(insulin like growth factor， IGF)

IGF-1具有促进软骨细胞分泌细胞外基质的作用，同时通过降低MMP-2来减少细胞外基质的降解。Osada等[30]应用原位杂交方法证实髓核细胞中有IGF-1 mRNA表达，同时这些细胞有自分泌和旁分泌功能。Gruber等[31]2002年报道将体外单层培养的椎间盘细胞加入IGF-1，细胞凋亡延缓。Allen等[32]2005年报道IGF-1通过调控Bcl/Bax平衡或者磷脂酰肌醇3-激酶和原蛋白激酶有丝分裂通路来抑制细胞凋亡。

2.2.2.2 BMP

BMP属于转化生长因子β(transforming grouth factor-β,TGF-β)超家族成员，目前主要研究BMP-2和BMP-7。BMP-2是一种多功能生长因子，能刺激细胞外基质合成，调节细胞生长分化和凋亡，对软骨形成和维持细胞表型有重要作用。Kim等[33]报道重组BMP-2能促进人退变椎间盘细胞Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原mRNA的表达和蛋白多糖合成。Li等[34]2004年报道在大鼠椎间盘细胞加入BMP-2后Ⅱ型胶原mRNA的表达和蛋白多糖合成增加，TGF合成也增加。Gamradt等[35]2006年报道成功应用腺病毒载体携带重组BMP-2基因转染兔骨髓细胞并在体内持续表达12周。综上，重组BMP-2可以延缓甚至逆转椎间盘退变。BMP-7又称成骨蛋白,对胶原合成及蛋白质合成积聚起刺激作用。Takegami等[36]2002年报道BMP-7促进蛋白多糖合成，还能通过抑制白介素-1减少蛋白多糖分解。An等[37]2005年报道向正常兔椎间盘中注射BMP-7，2周后注射组椎间盘高度较对照组增加15%，4～8周后效果仍显著。以上结果表明重组BMP-7可以促进蛋白多糖合成。

2.2.3 TGF-β

TGF-β是目前研究最广也是最深入的一种细胞因子。它是一种具有多种功能的蛋白多肽，广泛存在于动物正常组织细胞以及转化细胞中。Thompson等[38]一项体外实验中，外源性TGF-β1促进犬髓核细胞蛋白多糖合成，这也是首次应用细胞因子延缓椎间盘退变。此后，不断有报道提示TGF-β促进椎间盘细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原。

2.2.4 细胞内调节因子

Sox-9基因是Sox基因家族成员之一，软骨细胞Ⅱ型胶原合成过程的关键转录因子。Paul等[39]2003年报道将Sox-9基因转染至兔退变的椎间盘细胞中，5周后Ⅱ型胶原合成增加，软骨细胞维持原有表型，而对照组中髓核细胞的数量已经下降，并被成纤维细胞取代。2007年Liu等[40]报道通过重组病毒Sox-9基因转染至退变的椎间盘细胞中结果提示Sox-9基因可以在体内表达。以上结果表明Sox-9基因能够延缓椎间盘的退变。

2.3 基因治疗的安全调控

引入非特异性基因的治疗模式中应用较多的是cDNA。它是一种结构基因，自身没有调控表达的能力，这种基因的表达调控依赖于转基因的载体。同时基因表达的调控具有多层次性，其中转录水平调节是基因表达的基本控制点。它包括启动子、增强子、沉默子、加尾PolyA信号等[41]。由于基因载体大多数都是病毒，不可避免的都有毒副作用，因此需要病毒的量尽可能少。Moon等[42]2008报道人髓核细胞在体内外分别予以腺病毒载体TGF-β1、BMP-2、IGF-1单独或者联合转染，结果提示蛋白多糖在使用单一治疗基因时增加180%～295%，而在联合使用2种治疗基因时蛋白多糖增加322%～398%，更令人鼓舞的是，联合使用3种治疗基因时蛋白多糖增加471%。将来的研究趋势是否能够与抗分解因子联合使用来进一步减少病毒量。另外，当前还有一些转基因表达系统，比如热休克蛋白、类固醇激素启动子、四环素等。这些表达系统大多数都是通过活化载体上的治疗基因，类似于开关系统。Chtarto等[43]2003报道使用四环素调节系统调节腺相关病毒载体转染。Ueblacker等[44]2004年报道应用四环素调节系统在兔骨软骨缺损模型中获得成功。下一步的目标是使四环素系统更加高效、加载药量更小、副作用更小。

另外，目前比较流行的RNA干扰技术，可以特异性剔除或关闭特定基因的表达。因此在椎间盘退变中将促分解代谢因素的基因抑制或者降低表达是另外一种可选择的治疗途径。Kakutani等[45]2006年报道使用RNA干扰技术分别在体外培养大鼠和人髓核细胞，结果提示大鼠中荧光酶基因表达下降94.7%，在人髓核细胞中荧光酶基因表达下降93.7%，并且这种抑制效应持续3周。

3 展 望

自从1997年Wehling等首先提出转基因逆转椎间盘退变的设想，椎间盘退变基因治疗研究已达16年，目前仍处于实验研究初级阶段，要真正运用于临床仍需要深入开展大量的研究工作。具体一些策略如下：①进一步明确椎间盘退变的分子生物学机制，找出更多的相关基因。②深入研究目前关注的一些细胞因子cDNA转染椎间盘细胞后的表达及其副作用，以进一步证明其在基因治疗方面上的临床意义。③寻找新的更有效的细胞因子，同时研究各种细胞因子之间的相互作用，在此基础上尝试多基因转移的可能性。④深入研究外源性基因表达调控，使得目的基因适时适量表达，最终发挥生物效应。⑤目前采取的病毒载体在转染椎间盘细胞方面存在一些问题，需通过不断改进逐步解决一些困难，同时努力开发新的更高效更安全的载体。⑥探索和改进组织工程技术，在基因转移的策略上坚持从间接基因疗法上突破。⑦扩大基因治疗模式，如基因增补或者反义技术等。

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