白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α对人正常髓核细胞基质金属蛋白酶-28转录影响的研究

张伟军，冯 虎，丁亚军，邓 斌，蒋允昌，章浩杰，夏 震

下腰痛是一种很常见的疾病，据统计超过一半的人，在一生中的某个阶段都会出现下腰痛[1]，研究显示基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases,MMPs)与椎间盘退变之间关系密切，是导致椎间盘退变的主要原因之一，MMPs是参与降解包括骨在内的全身各种组织细胞外基质的蛋白酶家族，包括基质中以及整合于质膜中的各种胶原酶和弹性蛋白酶等，因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名[2]，基质金属蛋白酶-28(matrix metalloproteinase-28,MMP-28)是MMPs的最新成员，最新研究发现其与髓核细胞退变密切相关，本实验通过炎性介质白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激体外培养人体髓核细胞，采用实时聚合酶链反应(real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测髓核细胞MMP-28 mRNA转录水平，探讨MMP-28的调控因素及炎性介质和MMP-28与髓核细胞退变之间的关系。

1 资料和方法

1.1 主要资料和试剂

人体髓核原代细胞株(美国Sciencell公司)，重组人IL-1β(美国Perprotech公司)，重组人TNF-α(美国Perprotech公司)，DNA Marker 1(北京天根公司)，Trizol法总RNA提取试剂盒(北京天根公司)，cDNA第一链合成试剂盒(北京天根公司)，PCR试剂盒(北京天根公司)，焦碳酸二乙酯 (diethy pyrocarbonate,DEPC，上海浩然公司)，溴化乙锭(ethidium bromide,ED)染料(北京天根公司)，琼脂糖(Agarose，LMP，美国Promega公司)异丙醇(上海化学试剂公司)，氯仿(上海化学试剂公司)， 无水乙醇(上海化学试剂总厂)，TBE电泳缓冲液(上海化学试剂公司)，胰蛋白酶(南通碧云天公司)引物(上海捷瑞生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞因子模型

髓核细胞培养至第2代，当达90%融合时，常规消化、离心、制成细胞悬液，用血球计数板计数后接种于六孔培养板中，每个孔内约有2.5×105个细胞。空白对照组：不加任何致炎因子，只加培养基进行常规培养。实验组：配制不同浓度的致炎因子加入培养孔内作为实验组，即10 ng/mL IL-1β组、50 ng/mL IL-1β组、50 ng/mL TNF-α组、100 ng/mL TNF-α组。每个浓度组设立三复孔。每隔24 h更换空白对照组和实验组培养基，实验组细胞因子浓度保持不变。常规培养72 h。

1.2.2 髓核细胞RNA提取

吸去培养孔的上清，加入1 mL Trizol裂解液，收集至离心管，加入氯仿摇匀，离心后转移水相至新的离心管，加入异丙醇，离心后弃上清，加入乙醇，振荡混匀，离心后吸去上清后空气中干燥5～10 min，加入30 μL DEPC水溶解RNA。计算RNA样本的纯度，达1.8后进行下一步。

1.2.3 RT-PCR反应

MMP-28及内参(β-肌动蛋白)引物见表1，RT-PCR步骤具体见试剂盒说明。

1.2.4 PCR产物观察

取PCR产物3 μL加3 μL的DNA电泳上样缓冲液上样，同时取DNA Marker 6 μL上样，电压110 V，电流50 mA电泳30～40min，扩增得到相应的目的产物片段，用凝胶数字成像系统扫描分析扩增产物条带，分别测定各扩增带灰度值，以各自目的基因扩增带灰度值与内参扩增带的灰度值比，作为其mRNA水平的指标。

表1 MMP-28、β-肌动蛋白上下游引物序列Tab.1 MMP-28,β-actin upstream and downstream primer sequences

2 结 果

不同浓度的IL-β刺激人体髓核细胞(见表2，图1)。各组数据均满足正态性和方差齐性，采用单因素方差分析，F=1.253，P>0.05，各组间差异无统计学意义，未发现IL-1β影响人体正常髓核细胞MMP-28mRNA转录。

表2 IL-1β刺激人正常髓核细胞72 h后MMP-28 mRNA的转录水平Tab.2 MMP-28 mRNA transcriptional level in human nucleus pulposus cells after 72 h IL-1β stimulation

不同浓度的TNF-α刺激人体髓核细胞(见表3，图2)。各组数据均满足正态性和方差齐性，采用单因素方差分析，F=279.510，P<0.05，总体之间差异存在统计学意义，可进行组间比较：低浓度与空白对照组相比，P<0.01，差异有统计学意义；高浓度与低浓度组相比，P<0.01，差异有统计学意义，TNF-α对髓核细胞MMP-28 mRNA转录具有刺激作用，且高浓度上调作用更明显。

a,b：空白对照组(0 ng/mL) c,d:低浓度组(10 ng/mL) e,f：高浓度组(50 ng/mL)
a,b：Control group (0 ng/mL) c,d: Low concentration group (10 ng/mL) e,f：High concentration group (50 ng/mL)
图1 不同浓度的IL-1β刺激髓核细胞72 h后MMP-28 mRNA转录水平
Fig.1 MMP-28 mRNA transcriptional level in human nucleus pulposus cells after 72 h different IL-1β stimulation

表3 TNF-α刺激人正常髓核细胞72 h后MMP-28mRNA的转录水平Tab.3 MMP-28 mRNA transcriptional level in human nucleus pulposus cells after 72 h TNF-α stimulation

注： *与空白对照组相比，P<0.05；**与另2组比较，P<0.01
Note: *Compared with control group,P<0.05；**compared with other groups,P<0.01

3 讨 论

MMP-28是MMPs的最新成员，MMP-28又名上皮水解素(epilysin),最初克隆自人的角质形成细胞、睾丸和混合性肿瘤cDNA文库[3-4]。重组体MMP-28在体外实验证实可以降解酪蛋白，一种非特异性、很多酶都可以水解的蛋白，然而在体内其作用底物仍不详，Gruber等[5]首次报道发现MMP-28同样存在于人体椎间盘组织，并认为MMP-28与人体椎间盘退变密切相关。

退变椎间盘组织内检测到大量炎性因子，学者们就MMPs、炎性因子、椎间盘退变之间做了大量研究，Le Maitre等[6]研究发现IL-1表达量增加，可诱发椎间盘细胞基质降解酶如MMP-1、3、7、13和含凝血酶敏感素4型基序的解聚素样金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4,ADAMTS-4)表达量增加，致使基质蛋白合成减少，降解增加，导致相应细胞生化特性改变，最终发生退变。Séguin等[7]研究发现，TNF-α可以下调蛋白聚糖和Ⅱ型胶原基因表达，减少蛋白聚糖和胶原的合成，并且还可以增加MMP-1，MMP-3，MMP-13，ADAMTS-4及ADAMTS-5，从而降解椎间盘基质，由此可见TNF-α能够促进椎间盘退变。

a,b：空白对照组(0 ng/mL) c,d:低浓度组(50 ng/mL) e,f：高浓度组(100 ng/mL)
a,b： Control group (0 ng/mL) c,d: Low concentration group (50 ng/mL) e,f：High concentration group (100 ng/mL)
图2 不同浓度的TNF-α刺激髓核细胞72h后MMP-28 mRNA转录水平
Fig.2 MMP-28 mRNA transcriptional level in human nucleus pulposus cells after 72 h different TNF-α stimulation

然而关于炎性因子调控MMP-28的报道甚少，Saarialho-Kere等[8]报道TNF-α可以在体外诱导角质形成细胞MMP-28表达增加。本研究通过体外培养正常人体髓核细胞，用不同浓度的IL-1β(0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)和TNF-α(0 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL)刺激髓核细胞，72 h后检测细胞中MMP-28 mRNA转录水平。IL-1β刺激72 h后发现低浓度组(0.343±0.018)、高浓度组(0.343±0.018)与空白对照组(0.325±0.019)之间差异无统计学意义(P>0.05)，未发现IL-1β对MMP-28 mRNA转录具有调控作用，但是低浓度TNF-α(50ng/mL)刺激后即发现MMP-28 mRNA转录水平(0.515±0.029)明显上调(P<0.01)，随着TNF-α浓度增加(100 ng/mL)MMP-28 mRNA转录水平(0.610±0.012)继续上调(P<0.01)。TNF-α对MMP-28具有调控作用，且呈浓度依赖性。结合Séguin等[7]结果，推测MMP-28可能是TNF-α参与椎间盘退变的介质之一。IL-1β不能影响髓核细胞MMP-28 mRNA转录，而TNF-α对MMP-28 mRNA转录有刺激作用，且呈浓度依赖性，这与Saarialho-Kere等[8]报道类似。也有研究表明，TNF-α对髓核细胞MMP-28的表达无明显调控作用，但其实验对象是退变髓核细胞，结合本实验结果，推测TNF-α可能只在早期参与调控正常髓核细胞MMP-28表达，当髓核细胞发生退变后，可能对TNF-α反应降低，从而出现TNF-α不能有效刺激退变髓核细胞表达MMP-28的现象。

本研究仅建立单一炎症因子刺激的体外细胞培养模型，不能完全代表人体内复杂的生理环境，由于多种炎症因子参与椎间盘退变，且细胞因子之间是相互影响、相互依赖的，关于炎症因子与MMP-28之间的相互作用及如何影响椎间盘退变还需要更深入的研究。

椎间盘不仅是椎体间强有力的连接结构，同时也是很好的震荡吸收装置，施加于脊柱的各种不同载荷，引起椎间盘的相应变形，使力得到重新分布及部分吸收，此生物学功能主要依赖椎间盘细胞外基质完成，一旦基质破坏将导致椎间盘不能有效的、均匀的重新分布及吸收载荷，出现应力集中，最终将发生椎间盘突出。椎间盘突出的治疗，不论是非手术还是手术，都各有利弊，采用分子生物学途径抑制椎间盘细胞外基质降解，阻止椎间盘退变才是最有效的治疗，本实验试图探讨MMP-28与椎间盘的退变的关系，为椎间盘退变的靶向治疗提供思考。

参考文献

[1] McBeth J,Jones K. Epidemiology of chronic musculoskeletal pain[J]. Best Pract Res Clin Rheumatol,2007,21(3):403-425.

[2] 严广斌. 基质金属蛋白酶[J]. 中华关节外科杂志:电子版,2010,4(4):566.

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[4] Marchenko GN,Strongin AY. MMP-28,a new human matrix metalloproteinase with an unusual cysteine-switch sequence is widely expressed in tumors[J]. Gene,2001,265(1-2):87-93.

[5] Gruber HE,Ingram JA,Hoelscher GL,et al. Matrix metalloproteinase 28,a novel matrix metalloproteinase,is constitutively expressed in human intervertebral disc tissue and is present in matrix of more degenerated discs[J]. Arthritis Res Ther,2009,11(6):R184.

[6] Le Maitre CL,Freemont AJ,Hoyland JA. The role of interleukin-1 in the pathogenesis of human intervertebral disc degeneration[J]. Arthritis Res Ther,2005,7(4):R732-R745.

[7] Séguin CA,Pilliar RM,Roughley PJ,et al. Tumor necrosis factor-alpha modulates matrix production and catabolism in nucleus pulposus tissue[J]. Spine (Phila Pa 1976),2005,30(17):1940-1948.

[8] Saarialho-Kere U,Kerkel? E,Jahkola T,et al. Epilysin (MMP-28) expression is associated with cell proliferation during epithelial repair[J]. J Invest Dermatol,2002,119(1):14-21.