水貂绿脓杆菌的分离与鉴定

马 俊，张 超，曲新泽，樊虓翀，林逢生

（上海启盛生物科技有限公司，上海 201203）

水貂绿脓杆菌的分离与鉴定

马 俊，张 超，曲新泽，樊虓翀，林逢生

（上海启盛生物科技有限公司，上海 201203）

2011～2013年间，从山东省、河北省和江苏省等地的多个貂场疑似水貂出血性肺炎病貂的肺脏、肝脏和脾脏中分离到425株疑似绿脓杆菌。用绿脓杆菌的OprF和PEA基因的PCR引物对分离菌株的目的基因扩增，经核苷酸测序确定其均为绿脓杆菌序列。通过日本生研株式会社血清学分型系统进行分型：G型376株，占88.5%；B型34株，占8%；C型12株，占2.8%；E型3株，占0.7%。取其中6株细菌（G血清型3株，其他血清型各1株）进行详细生化试验，结果显示该6株菌均符合绿脓杆菌的生化特性，并且从这6株中选4株细菌（每血清型各1株）腹腔接种小白鼠和气管内接种水貂，结果表明4株菌对其均有致病性。

出血性肺炎；绿脓杆菌；血清型；分离与鉴定

绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）或称铜绿假单胞菌是引起水貂出血性肺炎的病原体。水貂出血性肺炎是一种以出血性肺炎和败血症为主要特征的急性传染病，发病急，死亡快，常呈地方性季节性暴发流行，发病貂场死亡率在10%～50%[1]，给养貂业造成了很大的经济损失。1953年Knox等[2]在丹麦首次报道了水貂出血性肺炎。该病在瑞典、芬兰、美国、法国、日本等国均有报道。1984年，中国潘镰生[3]首次报道了该病，此后陆续有发生[4-6]，近几年来根据有关报道[7-8]和我们的现场调查结果表明，该病在各养貂省如山东省、吉林省、黑龙江省、河北省、内蒙古自治区古相继频繁暴发。2011年9月，威海市荣成地区某貂场养殖1万只水貂，发生水貂出血性肺炎，共死亡1600 多只，病死率达到16%。2012年8月，潍坊诸城市某貂场养殖量为6000只，8月份时出现呼吸困难、咳嗽、死前口鼻出血等呼吸道症状，持续死亡达十多天，每天死亡10多只，高峰期可达60只，死亡率达22%，造成严重的经济损失。2012 年10月，文登市宋村镇某水貂养殖场发生水貂出血性肺炎，死亡率高达35%。引起水貂出血性肺炎的绿脓杆菌血清型很多，不同血清型之间几乎没有交叉免疫保护，并且对抗生素的耐药性强，给水貂出血性肺炎的防治工作带来很多的困难。

本实验室在2011～2013年间，从山东省、河北省和江苏省等地的病貂肺脏、肝脏、脾脏中分离了425株绿脓杆菌，进行了分子生物学和生化特性鉴定、血清学分型及动物感染试验的系统研究，并且首次在国内分离到水貂绿脓杆菌E血清型菌株，为我国水貂出血性肺炎防治研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料与实验动物病料采集自山东省即墨市、海阳市、荣成市、文登市、诸城市、河北省昌黎县、唐山市乐亭县和江苏省连云港市等地的貂场；PCR所用阳性对照鸡绿脓杆菌菌株为扬州大学传染病实验室馈赠；微量生化反应鉴定管（广州环凯微生物科技有限公司）；绿脓杆菌血清分型用标准阳性血清（日本生研株式会社）；溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基：每升培养基中含蛋白胨10 g、氯化钠5 g、牛肉浸出粉3 g、溴化十六烷基三甲胺0.3 g、琼脂14 g，调整pH为7.5，121 ℃灭菌20 min；ICR小鼠：SPF级、雌性、体重约20 g、约5周龄，上海西普尔-必凯实验动物有限公司；水貂：健康黑色标准貂、雌性、年龄约4个月龄，购自上海市南汇区某貂场。

1.2 细菌分离打开患疑似出血性肺炎病貂的胸腔和腹腔，无菌采集肺脏、肝脏、脾脏病料接种于溴化十六烷基三甲胺琼脂选择培养基，37 ℃培养18～24 h，对生长的疑似菌落连续传代进行革兰氏染色及形态观察。

1.3 分子生物学鉴定绿脓杆菌的外毒素A（PEA）是重要的致病因子；外膜蛋白F（OprF）是绿脓杆菌的最重要外膜蛋白之一，抗F蛋白抗体对绿脓杆菌具有高度的特异性，与免疫保护有关[9-14]。所以我们根据GenBank提交的序列（GenBank登录号: NC_002516.2）设计了针对PEA和OprF的两对引物以对分离的细菌进行PCR扩增。煮沸法制备细菌PCR模板，利用PCR扩增绿脓杆菌的PEA基因和OprF基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

扩增PCR程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，扩增30个循环；72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR产物加在含有5 μg/mL EB的1%琼脂糖凝胶中，以标准100 bp DNA Marker作为参考，100 V电泳40 min，在凝胶成像仪上观察。有特异性条带，切胶，按照DNA纯化试剂盒说明书进行胶回收，送到生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

表1 用于扩增OprF和PEA基因的引物序列Table 1 Sequences of the primers used to amply OprF and PEA genes

1.4 血清学鉴定用玻板凝集试验进行血清型分型。按日本生研株式会社的绿脓杆菌血清学分型试剂盒操作说明进行操作：将待检测菌株单菌落接种于溴化十六烷基三甲胺液体培养基中过夜培养，离心重悬后取一滴与30 μL分型血清进行混合，同时设抗原与生理盐水反应作为阴性对照组。充分混合后，1 min内观察结果。

1.5 生物学特性经过血清学和分子生物学鉴定后，从中挑取6株待检菌株（M02、M06和MJM1株为G型，M03株为B型，M12株为C型，M13株为E型）单菌落，接种生化反应管进行生化项目测定，生化反应条件按说明书进行。

1.6 致病性试验G、B、C、E四种血清型各挑选一株（MJM1、M03、M12和M13株）进行动物致病性试验。

1.6.1 小鼠致病性试验 取25只小鼠，随机分为5组，每组5只，第1～4组为攻毒组。上述4种血清型菌株的16 h培养液进行10倍稀释后，分别腹腔接种第1～4组小鼠，0.5 mL/只，同时进行活菌计数；第5组为对照组，腹腔接种细菌培养基，0.5 mL/只。攻毒后连续观察5日，记录小鼠的临床症状和死亡情况。

1.6.2 水貂致病性试验 上述4种血清型菌株在37 ℃摇床培养18 h，原液做10倍系列稀释作为水貂接种物，并进行活菌计数。取82只约4月龄健康母貂，随机分为17组，其中第1～16组，每组5只，剩余1组（第17组）2只作为对照。每株菌接种4组水貂，分别气管内接种100、10-1、10-2、10-3的稀释菌液，0.5 mL/只；对照组，气管内接种细菌培养基，0.5 mL/只。攻毒后连续观察5日，记录水貂的临床症状和死亡情况，用Reed- Muench法计算每种菌对水貂的LD50。

2 结果

2.1 细菌分离和培养特性将貂场采集的病料划线接种于选择培养基，37 ℃培养18～24 h。若在培养基上菌落呈微隆起或扁平状向周边扩散或略有蔓延，表面光滑湿润，菌落周围培养基常扩散有水溶性绿色或褐色色素，经革兰氏染色为阴性，呈两端钝圆的杆菌，单个或成双排列的分离菌，初步判定为绿脓杆菌，共425株。普通平板上菌落形态及革兰氏染色结果分别见图1和图2。

图1 绿脓杆菌菌落形态Fig.1 Colony morphology of Pseudomonas aeruginosa

图2 绿脓杆菌革兰氏染色Fig.2 Gram staining of Pseudomonas aeruginosa

2.2 分子生物学鉴定分离的425株菌，OprF引物扩增的目的条带大小约为1400 bp，PEA引物扩增的目的条带大小约1600 bp，与预期结果相符，M03（B血清型）、M06（G血清型）、M12（C血清型）和M13（E血清型）的PCR结果见图3。PCR片段经序列分析比对，结果表明以上2.1初步判定为绿脓杆菌的425株确实为绿脓杆菌菌株。

图3 4种血清型绿脓杆菌PCR鉴定结果Fig.3 Results of PCR amplif cations of Pseudomonas aeruginosa of 4 serotypes

2.3 血清学鉴定依照日本生研说明书进行试验，若待检菌液与特异血清反应出现凝集块，且生理盐水空白对照不凝集者为阳性，没有凝集则为阴性。结果显示所分离的425株绿脓杆菌均能与G型或B型或C型或E型抗血清发生凝集，其中G型376株，占88.5%；B型34株，占8%；C型12株，占2.8%；E型3株，占0.7%。从分离到不同血清型菌株的临床病料来源看，E型、C型菌株均与G型或B型菌株混合感染。

2.4 生化特性选取的6株细菌生化试验结果见表2，生化试验结果均符合绿脓杆菌的生化特性。

表2 选取的6株绿脓杆菌生化试验结果Table 2 Biochemical test results of 6 pseudomonas aeruginosa isolates selected

2.5 致病性试验

2.5.1 小鼠的致病性 所有接种绿脓杆菌的小鼠在攻毒后24 h内死亡，死亡率达100%，而对照组5只小鼠均健活，活菌计数得出各血清型绿脓杆菌菌株小鼠的攻毒剂量。MJM1（G型）：1.2×108cfu；M03（B型）：1.0×108cfu；M12（C型）：1.3×108cfu； M13（E型）：1.5×108cfu。

2.5.2 水貂的致病性 水貂气管内接种这4株菌后，发生了不同程度的死亡，而对照组水貂均健活，详细情况见表3。用Reed-Muench方法计算MJM1、M03、M12和M13株绿脓杆菌的LD50分别为7.6×106、1.6×107、5.2×106和2.0×107cfu。

表3 4株绿脓杆菌对水貂的致病性和LD50测定Table 3 The pathogenicity of the 4 pseudomonas aeruginosa isolates in minks and determination of LD50

3 讨论

本实验室采用绿脓杆菌选择培养基，从多个水貂养殖场爆发疑似水貂出血性肺炎的水貂内脏中分离细菌。根据菌落形态、所产的色素、革兰氏染色、OprF基因和PEA基因PCR扩增及序列测定对比，确定425株分离菌为绿脓杆菌。在此基础上，采用日本生研株氏会社的血清分型系统对这425株细菌进行了分型。其中G型376株，占88.5%；B型34株，占8%；C型12株，占2.8%；E型3株，占0.7%；水貂绿脓杆菌E血清型首次在我国报道。2011年白雪等[7]首次对分离的45株水貂绿脓杆菌进行血清型分型（日本生研分型系统）：G 型42株（占93.4%）、B型2株（占4.4%）和I型1株（占2.2%），并报道，近10年来特产所从全国各地收集的67株水貂绿脓杆菌主要为G、B和C型，但没有提到具体的百分数，与欧洲和美国报道的主要流行血清型基本相同[1,7,8]。各报道中每个血清型的比例存在一定的差距，如Hammer等[1]报道在丹麦从1998至2001年期间74个水貂场发生的出血性肺炎病料中，分离到的168株绿脓杆菌中，G型117株，占69.6%；B型21株，占12.5%；C型30株，占17.8%。本实验室分离出的C型和E型菌株均是从G型或B型菌株感染的病例中分离到的，是混合感染，并且在同一临床样品中，G型或B型菌株是占绝对多数；并且，从菌落形态、所产的色素、革兰氏染色结果很难区分不同的血清型菌株，这可能导致C型、E型菌株分离率较低。

根据发表的文献报道，水貂绿脓杆菌同一血清型的不同菌株或同一菌株对水貂和小鼠的致病性有所不同。本试验选取的4株（G、B、C和E血清型各1株）对小鼠和水貂均有致病性，并且通过水貂气管内接种各血清型菌株，得出各血清型菌株对水貂半数致死量（LD50）没有很大的差别（少于5倍量），说明各血清型的绿脓杆菌均存在对水貂毒力强的菌株。

近年来，水貂出血性肺炎发生频率逐年上升，已成为水貂养殖业的大病，给养殖业带来巨大的损失。同时，水貂出血性肺炎临床流行现状也出现了新趋势，发病区域由沿海地区向内地蔓延，以前集中在大连市、山东省沿海等地，近来在河北、吉林省等内陆地区发病日益增多；发病高峰期变长，以往集中在8、9月份，现在6月初即有绿脓杆菌导致的出血性肺炎发生，7～10月都是该病发病高峰期。已有的文献报道和我们的试验结果（没有发表）表明G、B、C和E血清型之间没有交叉保护或交叉保护力很低，故疫苗包含的血清型最好能涵盖所有流行血清型，国外这4个血清型的多价苗在市场上已应用多年，国内研发出能够保护所有流行血清型的多价疫苗是目前预防该病的一个重要研究方向。绿脓杆菌引起的出血性肺炎发病急、死亡迅速，发现发病时往往来不及投药治疗，所以采取预防加治疗的方式，可以有效的减少发病概率和经济损失。由于在临床生产中抗生素的不合理使用，绿脓杆菌已对大部分抗生素产生了耐药性，故一旦发现疫情后，需充分利用临床诊断和实验室检验，通过药敏试验选择合理的敏感抗生素进行交叉投喂，并大群紧急接种多价疫苗，可有效的控制病情，减少损失。

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ISOLATION AND IDENTIFICATION OF PSEUDOMONAS AEROGINOSA OF MINKS

MA Jun, ZHANG Chao, QU Xin-ze, FAN Xiao-chong, LIN Feng-sheng
(Shanghai Qisheng Biotechnology Co. Ltd, Shanghai 201203, China)

Total 425 isolates of suspectedPseudomonas aeroginosawere isolated from 2011 to 2013 from lungs, spleens and livers collected during breakouts of hemorrhagic pneumonia on mink farms in Shandong, Hebei and Jiangsu provinces. Two pairs of PCR primers were designed based on sequences of OprF and PEA genes, respectively. The DNA templates were extracted from these 425 isolates and amplif ed in PCR using the primer sets. The sizes of PCR products and nucleotide sequences conf rmed that all 425 isolates were minkPseudomonas aeroginosa. Serological typing divided these isolates into 4 serotypes: 376 (88.5%) isolates in G serotype, 34 isolates (8.0%) in B serotype, 12 isolates (2.8%) in C serotype and 3 isolates (0.7%) in E serotype. Six isolates (3 from G serotype and one from each of other 3 serotypes) were randomly selected for further biochemical tests. All of these 6 isolates met requirements forPseudomonas aeroginosa. In addition, 4 out of these 6 isolates (one serotype each) were inoculated into mice and minks and caused all animals sick.

Hemorrhagic pneumonia;Pseudomonas aeroginosa; serotype; isolation and identif cation

S852.614

A

1674-6422（2014）01-0044-06

2013-11-17

马俊，女，硕士研究生，预防兽医学专业

林逢生，E-mail：linfengsheng@bioqy.com