H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法的建立及初步应用

申伟霞，田巧珍，陈 圆，胡 涛，闫丽萍，李国新，李雪松，滕巧泱，赵宇军，李泽君

（1.山西农业大学动物科技学院，太谷 030801; 2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法的建立及初步应用

申伟霞1,2，田巧珍2，陈 圆2，胡 涛2，闫丽萍2，李国新2，李雪松2，滕巧泱2，赵宇军1，李泽君2

（1.山西农业大学动物科技学院，太谷 030801; 2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

虽然H3、H9亚型禽流感病毒（Avian inf uenza virus, AIV）是低致病性禽流感病毒，但其具有跨宿主感染哺乳动物的能力，对社会公共卫生安全具有重大的潜在危害，因而对这些亚型病毒的监测极其重要。通过比对GenBank上H3、H9亚型禽流感病毒HA基因序列，设计了分别针对H3 AIV和H9 AIV的特异性探针。特异性试验和标准曲线试验的结果显示，这两个探针仅分别特异性识别H3、H9亚型AIV，且具有较好的扩增效率。通过重组质粒pMD19-T-H3HA和pMD19-T-H9HA 10倍梯度稀释液为模板，进行敏感性实验。结果表明，本研究所建立的荧光定量PCR方法能检测到100个DNA拷贝数H3 AIV和10个DNA拷贝数的H9 AIV，比传统PCR方法敏感性分别提高了100倍和1000倍。此外，本方法还能检测到10 EID50的H3亚型AIV或H9亚型AIV，比传统PCR方法检测敏感性均提高了1000倍。批间和批内试验的变异系数均小于3%，表明本研究建立的方法具有较好的重复性。此外，与传统PCR方法相比，用H3、H9亚型AIV双重荧光定量PCR方法检测人工感染动物的肺组织时，针对H3 AIV的敏感性提高了10～100倍，针对H9 AIV的敏感性提高了100倍。综上所述，本研究所建立的H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法具有较高的特异性和敏感性，对H3、H9亚型禽流感病毒监测具有重要的应用价值。

H3；H9；禽流感病毒；荧光定量PCR

禽流感（avian influenza，AI）是由正粘病毒科A型流感病毒（Avian influenza virus，AIV）所引起的一种主要流行于鸡群中的禽类高度接触性传染病。根据禽流感病毒致病性的不同，可分为高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒[1]。据报道，H3、H4、H9、H10等亚型低致病性禽流感病毒均在我国流行[2]。我国自1994年首次报道鸡群分离到H9N2亚型禽流感病毒以来[3]，H9亚型低致病性禽流感病毒广泛存在于我国辽宁省、安徽省、山东省、广东省、福建省、江苏省、河南省、湖南省、湖北省、上海市、广西壮族自治区、云南省、四川省、新疆维吾尔自治区等大部分地区[4]。低致病性的H9N2亚型禽流感病毒虽然不引起感染禽类的大量死亡，但是可导致感染禽产蛋下降和免疫抑制，与其他病原共感染时常导致高死亡率，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。H3亚型禽流感病毒是从野生鸟类和活禽市场分离到最常见的禽流感病毒之一[2,5]。此外，H3和H9亚型禽流感病毒皆获得直接感染哺乳动物的能力[6-8]，对人类社会的公共卫生安全具有极大的潜在威胁。

对于H3、H9等禽流感病毒传统的检测方法是首先通过接种鸡胚分离病毒，然后再检测鸡胚尿囊液的血凝效价并做血凝抑制实验检测。这种方法具有准确、敏感、可重复的优点，但是耗时长和费精力，不能满足疾病快速方便检测的需要。另外，禽流感病毒也可以通过传统PCR方法来检测，但其有一定的局限性，不能同时检测出几种亚型禽流感，同时传统PCR敏感性不高，容易出现漏检。本研究选择一种具有准确性高、敏感性高、快速、便捷的荧光定量PCR方法用于鉴别诊断H3和H9亚型禽流感病毒，并在人工感染动物的样品检测中进行了初步应用，取得了较好的效果。因此，本研究所建立的H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法具有很高的临床应用价值。

1 材料和方法

1.1 主要材料毒株：H3、H4、H6、H9、H10、H11等亚型禽流感病毒，鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）和鸭坦布苏病毒（Duck tembusu virus, DTMUV）皆保存于本实验室，具体如下：A/Duck/Shanghai/68/2009（H3N2）（简称为SH68）、A/Duck/Shanghai/28-1/2009（H4N2）、A/Chicken/Guangdong/1268/2010（H6N2）、A/Chicken/Shanghai/441/2009（H9N2）（简称为SH441）、A/Chicken/Shanghai/602/2009（H10N2）、A/Chicken/Nanjing/908/2009（H11N2）、疫苗株Lasota、A/Chicken/Nanjing/977/2009（NDV）、鸭坦布苏病毒(FX2010株)等病毒株。 试剂：RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司； M-MLV反转录酶、Ribonuclease inhibitor、10 mmol/L dNTP mix、Premix ExTaq、pMD19-T载体、JM109感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司；质粒抽提试剂盒购自Axygen公司。

1.2 引物和探针的设计根据GenBank数据库中已发表的H3亚型和H9亚型禽流感病毒株HA基因保守核苷酸序列，用DNAStar软件进行同源性分析，通过Primer 5.0软件设计H3亚型和H9亚型禽流感病毒对应的两对引物和探针（表1）。上述引物和探针由上海基康生物技术有限公司合成。

表1 H3亚型和H9亚型禽流感病毒荧光定量PCR检测所用的引物Table 1 The primers for f uoresendetection of H3 subtype and H9 subtype Avian inf uenza virus

1.3 提取RNA并合成cDNA根据Trizol LS Reagent使用说明书进行病毒RNA的抽提。用20 μL DEPC水溶解提取的RNA ，然后按M-MLV反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA。反应体系为20 μL：总RNA模板10 μL，12 bp引物2 μL，吹吸混匀，瞬时离心放于70 ℃孵育10 min，水溶2 min以上；之后加入以下试剂：5×Reverse Transcriptase M-MLV buffer 4 μL、10 mmol/L dNTP mixture 2 μL、Ribonuclease inhibitor（40 U/μL）0.5 μL、RNase M-MLV （200 U/μL）1 μL。30 ℃孵育10 min，42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育10 min。反应完成后，cDNA放于－20 ℃保存。

1.4 荧光定量PCR荧光定量PCR的体系为25 μL：超纯水 5.5 μL、Premix ExTaq12.5 μL、H3-NED 0.5 μL、H3-AIVF 1 μL、H3-AIVR 1μL、H9-FAM 0.5 μL、H9-AIVF 1 μL、H9-AIVR 1 μL、模板2 μL。PCR程序：95 ℃ 预变性2 min；95 ℃ 变性15 s、60 ℃退火 34 s，共40个循环。

1.5 常规PCR扩增H3 AIV常规PCR的体系为25 μL：超纯水 9.5 μL、PCR Mix 12.5 μL、H3HA-1F 1μL、H3HA-1319R 1 μL、模板 2 μL。 H9 AIV常规PCR的体系为25 μL：超纯水 9.5μL、PCR Mix 12.5μL、H9HA-151F 1μL、H9HA-638R 1μL、模板 2μL。PCR程序：95 ℃预变性 3 min；95 ℃ 变性30 s、53 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸 1 min，共30个循环；72 ℃延伸 10 min。

1.6 标准质粒的构建及标准曲线将H3N2亚型禽流感病毒SH68、H9亚型禽流感病毒SH441抽提RNA，并反转录为cDNA。根据A型流感病毒HA的通用引物SapI-HA-F （CACACAgctcttctattAGCAAAAGCAG GGG）和SapI-HA-R（CACACAgctcttcggccAGTA GAAACAAGGGTGTTTT），以上述cDNA为模板扩增H3亚型和H9亚型禽流感病毒的 HA基因的全片段，扩增程序：95 ℃预变性 3 min；95 ℃变性 30 s、53 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸2 min，30个循环；72 ℃再延伸10 min。电泳鉴定扩增的HA基因割胶纯化，分别连接到pMD19-T载体，并转化于JM109感受态细胞。

疑似阳性的重组质粒经PCR鉴定阳性后送invitrogen公司测序。该重组质粒分别命名为pMD19 -T-H3HA和 pMD19-T-H9HA。质粒抽提试剂盒说明书，将pMD19-T-H3HA菌液、pMD19-T-H9HA菌液抽提质粒。通过EPOCH（BioTek公司）仪器测定质粒浓度，计算DNA拷贝数，并分装存放于－20 ℃。

将pMD19-T-H3HA质粒和pMD19-T-H9HA质粒以10倍梯度稀释的标准品为模板，在ABI的7500荧光定量PCR仪上进行检测，获得模板拷贝数与临界循环数（threshold cycle，Ct）的标准曲线。

1.7 敏感性试验

1.7.1 DNA拷贝数敏感性 将pMD19-T-H3HA质粒和pMD19-T-H9HA质粒以10倍梯度稀释的标准品为模板，在ABI的7500荧光定量PCR仪上进行检测。通过不同浓度标准品的Ct值，判定该方法所能检测的最小DNA拷贝数量。以这些梯度稀释的质粒为模板，用H9HA-F、H9HA-R和H3HA-F、H3HA-R为引物(表1)，进行传统PCR方法来分别检测H9亚型、H3亚型禽流感病毒。PCR产物用1%琼脂糖电泳来鉴定。1.7.2 病毒滴度（EID50）敏感性 将H3N2亚型禽流感病毒SH68 (106.5EID50/100 μL)、H9N2亚型禽流感病毒SH441 (107.0EID50/100 μL)，用Trizol法抽提RNA并反转录为cDNA。10倍梯度稀释的cDNA为模板，用荧光定量PCR的方法检测，并记录Ct值。同样，以这些梯度稀释的cDNA为模板，用H9HA-F、H9HA-R和H3HA-F、H3HA-R为引物，进行传统的PCR方法检测。PCR产物用1%琼脂糖电泳来鉴定。

1.8 特异性试验分别以H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸡新城疫病毒 的cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测。

1.9 批内和批间试验为了测定荧光定量PCR方法的重复性，以3个不同浓度的pMD19-T-H3HA或pMD19-T-H9HA质粒为模板（1×107、1×106、1×105拷贝数/μL）。批内试验的变异系数是由每个浓度质粒重复5个孔测定的。批间试验的变异系数是由每个浓度质粒重复5次荧光定量PCR检测而来。

1.10 动物实验样品的检测将3周龄鸭滴鼻依次接种H9亚型禽流感病毒株SH441和H3亚型禽流感病毒株SH68, 剂量均为0.1 mL/只（106EID50），每个毒株接种3只鸭（n=3），并设立正常对照组，滴鼻接种PBS 0.1 mL/只。每天观察其临床症状，并于攻毒后第3日取所有鸭（包括攻毒组和正常对照组），采集肺。每个组织样品加1 mL PBS，10 800×g离心。取0.1 mL上清接9～11日龄SPF鸡胚，72 h取尿囊液，进行血凝试验；另一部分上清抽提RNA并反转录成cDNA。以10倍系列稀释的cDNA为模板，分别用荧光定量PCR和常规PCR方法检测。

2 结果

2.1 标准曲线以10倍梯度稀释的pMD19-T-H3HA质粒和pMD19-T-H9HA质粒的混合物为模板进行荧光定量PCR扩增，根据DNA拷贝数和Ct值绘制标准曲线。结果如图1所示，本方法H3亚型禽流感的扩增效率为0.98，且标准曲线的R2值为0.996，接近1；H9亚型禽流感的扩增效率为0.98，且标准曲线的R2值为0.998，接近1。产物的Ct值与浓度之间的线性关系非常好。

2.2 敏感性在本研究中，H3亚型禽流感病毒荧光定量PCR方法的DNA检测敏感性可达到102个DNA拷贝数。常规PCR扩增结果显示，该方法的敏感性只能达到104个DNA拷贝数（表2）。H9亚型禽流感病毒荧光定量PCR方法的DNA检测敏感性可达到10个DNA拷贝数。常规PCR扩增结果显示，该方法的敏感性只能达到104个DNA拷贝数（表2）。

抽取病毒尿囊液的RNA，以反转录成的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增，记录Ct值。结果如表3所示，用本研究的方法可以检测到10 EID50的H3亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒 (表3)。同时，以cDNA为模板进行传统的PCR方法检测，结果显示传统PCR分别只能检测到104EID50的H3亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒（表3）。

2.3 特异性以H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11亚型禽流感病毒及鸭坦布苏和鸡新城疫病毒cDNA为模板，进行荧光定量PCR方法检测。结果如图2所示，本研究所使用的Taqman探针能特异性地检测H3亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒，但不能检测H4、H6、H10和H11亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸡新城疫病毒。

2.4 重复性3个不同浓度的质粒pMD19-T-H3HA质粒和3个不同浓度的质粒pMD19-T-H9HA质粒，按同一浓度混合并将混合物作为模板，进行荧光定量PCR。如表4所示，表明批内试验和批间试验的变异系数均小于3%。本研究所建立的荧光定量PCR检测方法具有很好的重复性。

图1 荧光定量PCR的标准曲线Fig.1 The standard curve of f uorescence quantitative PCR

2.5 检测动物实验样品及临床样品为了检验本研究所建立的荧光定量PCR检测方法的实际应用效果，我们用该方法去检测人工感染动物样品。根据接鸡胚的结果显示，这些鸭子的肺组织均能检测到目的病毒。检测人工感染动物样品的结果显示，用荧光定量PCR检测H9亚型禽流感病毒的敏感性比传统PCR的方法提高100倍（表5），检测H3亚型禽流感病毒的敏感性比传统PCR的方法提高10～100倍（表6）。

3 讨论

H9N2亚型禽流感流行广泛，传播速度快，可引起雏鸡和育成鸡的隐性感染和产蛋鸡的产蛋下降且产蛋率难以恢复。H9N2亚型禽流感病毒本身对鸡只的致死性较低，但一旦其与细菌等混合感染鸡只，局面便无法控制。2011年冬天至2012年春天，我国的养鸡业损失惨重，成功率不足50%，其罪魁祸首就是H9亚型禽流感。H3亚型禽流感病毒最初仅发现存在于水禽上，但慢慢也获得了感染鸡的能力[10]。最近，H3亚型AIV跨宿主传播，获得感染犬的能力，陆续在韩国及中国被报道[8,11]，可见H3亚型AIV已慢慢地获得跨宿主传播与感染的能力，对人类的安全有潜在的危险。因此，目前迫切需要建立一种快速诊断H3、H9亚型禽流感病毒的方法。本研究通过primer 5.0软件，设计了特异的探针和引物。特异性实验结果表明，该探针只特异性地识别H3、H9亚型禽流感病毒HA基因。此外，从扩增效率图来看，该探针和引物的扩增效率较高，且DNA浓度与Ct值的线性关系好，方法可信度高。通过探针和引物所建立的荧光定量PCR法，整个过程仅耗时48 min。而传统PCR方法，因为结果需要跑核酸电泳来检测，所以整个过程至少需要3～3.5 h才能完成。用鸡胚接种法检测流感病毒准确，但耗时非常长，需3～4 d。总之，所建立的H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR检测方法，具有比常规方法更简单、快速的特点。

表2 荧光定量 PCR 方法和传统 PCR DNA 敏感性的比较Table 2 The sensitive comparison between fluorescence quantitative PCR and conventional PCR

表3 病毒滴度敏感性检测结果Table3 The detection sensitivity of virus titers

图2 荧光定量PCR检测的特异性Fig.2 The specif city of f uorescence quantitative PCR detection

表4 荧光定量PCR的批内和批间检测结果Table 4 The intra and inter dectection result of f uorescence quantitative PCR

表5 荧光定量PCR和传统PCR法检测H9 AIV感染鸭后的肺组织Table 5 The detection of lungs obtained from ducks infected with H9 AIV by f uorescence quantitative PCR and conventional PCR

表6 荧光定量PCR和传统PCR法检测H3 AIV感染鸭后的肺组织Table 6 The detection of lungs obtained from ducks infected with H3 AIV by f uorescence quantitative PCR and conventional PCR

目前，国内外已有禽流感病毒H5、H7和H9亚型禽流感病毒荧光定量PCR检测方法的相关报道[6-9]。在敏感性方面，本研究的荧光定量PCR方法检测敏感性能达到10～100个DNA拷贝数，比普通的PCR方法检测的DNA敏感性提高了100～1000倍。此外，本方法对H3或H9亚型禽流感病毒检测的敏感性也能达到10 EID50，比普通PCR方法检测的EID50敏感性提高了1000倍。批内、间试验结果也表明，H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR法具有较好的重复性。

利用建立的荧光定量PCR法，对人工感染的实验动物样品进行检测。结果表明，本研究所建立的荧光定量PCR法在检测肺的样品时，检测的敏感性较传统PCR的方法提高了10～100倍。

总之，本研究所建立的H3、H9亚型禽流感病毒荧光定量PCR检测方法，具有较好的准确性、特异性和敏感性，可很好地应用于H3和H9亚型禽流感病毒的临床检测，对我国广大地区H3、H9亚型禽流感疫病控制及其流行病学检测具有积极的科学意义。

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DEVELOPMENT AND PRELIMINARY APPLICATION OF FLUORESCENT QUATITATIVE PCR ASSAY FOR DETECTION OF H3 AND H9 SUBTYPES OF AVIAN INFLUENZA VIRUS

SHEN Wei-xia1,2, TIAN Qiao-zhen2, CHEN Yuan2, HU Tao2, YAN Li-ping2, LI Guo-xin2, LI Xue-song2, TENG Qiao-yang2, ZHAO Yu-jun1, LI Ze-jun2
(1. College of animal science and technology, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China ; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Although H3 and H9 subtypes of Avian inf uenza virus (AIV) are low pathogenic in birds, they have adapted abilities to infect mammalians, which poses potential threat to human beings. Therefore, surveillance of H3 and H9 subtypes of AIV is important for publichealth. In the present study, TaqMan primers specif c for either H3 or H9 subtype were designed to develop f uorescent quantitative PCR (qPCR) by comparing the homology of HA gene sequences submitted on the GenBank. The specif city testing and amplif cation trials demonstrated that TaqMan primers only recognized their respective H3 or H9 subtype. The sensitivity testing of the assay was performed using 10 fold serial dilutions of pMD19-T-H3HA and pMD19-T-H9HA as templates. The result showed that qPCR was able to detect 100 DNA copies of H3 subtype or 10 DNA copies of H9 subtype, which was 100 fold or 1000 fold higher than conventional PCR. In addition, this assay was also able to detect 10 EID50of both H3 and H9 subtypes, which was 1000 fold higher than conventional PCR. The interand intra-assay trials demonstrated that the variations were less than 3% for both subtypes, indicating its good reproducibility. Moreover, qPCR was used to detect viruses in lung samples from experimentally infected chickens. As compared to conventional PCR, qPCR was 10-100 fold more sensitive for H3 subtype or 100 fold more sensitive for H9 subtype than conventional PCR. Therefore, qPCR method developed in this study showed high specif city and sensitivity and could be used for epidemiological study of H3 and H9 subtypes.

H3 subtype; H9 subtype; Avian inf uenza virus; f uorescent quantitative PCR

S852.659.5

A

1674-6422（2014）01-0016-09

2013-12-18

国家高技术研究发展计划（863计划）（2011AA10A200）；国家自然科学基金项目（31302115）；中央级公益性科研所基本科研业务费专项资金项目（2013JB06）；公益性行业（农业）科研专项（201003012）；上海市科委现代农业领域重点科技攻关项目（12391902000）

申伟霞，女，硕士研究生，预防兽医学专业

李泽君，E-mail: lizejun@shvri.ac.cn；赵宇军，E-mail: tgzhaoyujun@163.com；滕巧泱，E-mail: tengqy@shvri.ac.cn