绵羊肺炎支原体黏附因子的定点突变及原核表达

程 晨，黄海碧,王晓晖，王仁超，谢红霞，郝永清

（1.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 010018；2.黑龙江省农垦建三江管理局动物卫生监督所，佳木斯 156300）

绵羊肺炎支原体黏附因子的定点突变及原核表达

程 晨1，黄海碧1,王晓晖1，王仁超1，谢红霞2，郝永清1

（1.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 010018；2.黑龙江省农垦建三江管理局动物卫生监督所，佳木斯 156300）

本研究采用点突变PCR方法成功克隆并表达了绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoiae, M.O）内蒙古分离株（SZWQ株）的黏附因子基因（SZWQ-860）。表达产物经SDS-PAGE电泳检测，与预期目的蛋白的大小一致，将重组蛋白纯化后经Western blot检测，结果表明重组蛋白具有良好的免疫反应性。

绵羊肺炎支原体；黏附因子; 定点突变；重组蛋白

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoiae, M.O）于1963年在英格兰由Mackya等[1]首次从绵羊体内分离出，1972年被 Carmihceal等[2]证明了这种支原体的致病性，并建议命名为“绵羊肺炎支原体”。M.O能引起绵羊以咳嗽、喘气、渐进性消瘦及慢性增生性间质性肺炎为特征的慢性呼吸道传染病[3]，不仅如此，羊感染绵羊肺炎支原体后，对其他病原（如多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌及流感病毒）的易感性明显增加[4]。本病在我国内蒙古自治区、云南省、四川省、宁夏回族自治区、甘肃省等地均有关于本病的报道，给养羊业带来了巨大的经济损失。虽然国内外均有对绵羊支原体肺炎减毒活疫苗和灭活疫苗研究和应用的报道，但免疫防护的效果都不是很理想。支原体的生长对培养基及培养条件的要求都很苛刻，培养难度大，故而菌产量低，极大地阻碍了支原体传统疫苗的研制。因此，生物技术疫苗的研究将是未来支原体疫苗的发展方向。

本研究克隆表达了绵羊肺黏附因子的基因，并对表达出的融合蛋白的免疫学活性进行检测，为绵羊肺炎支原体的生物技术疫苗的研制打下基础。

1 材料和方法

1.1 菌种与质粒M.O内蒙古分离株（SZWQ株）、E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、pET-32a为本实验室保存；一抗由本实验室制备保存。

1.2 工具酶与试剂PCR高保真酶（PrimeStar）、限制性内切酶（NcoⅠ、XhoⅠ）、T4 DNA ligase购于TaKaRa公司；支原体基因组提取试剂盒购于大连宝生物工程有限公司；凝胶回收试剂盒、快速质粒小量提取试剂盒购于Axgen公司；0.45 μm滤器为BIO-RAD产品；Ni+层析柱、醋酸纤维素膜、辣根过氧化物酶 (HRP）标记的羊抗兔IgG购于上海生工生物有限公司；其他试剂均为国产分析纯或试剂纯。

1.3 引物的设计与合成根据测序后SZWQ株的基因序列，采用Premier Primer 5.0软件设计SZWQ株的黏附因子基因（SZWQ-860）的特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。F1：5'-CCG CCA TGG CTA TGA AAA AGT TCT TCA ATT TTA AGC-3' ；R1 5'-GCT CAT CAT TTA TCC AGG ATT TTA TTT CTG ATT C-3' ；F2 ：5'-CCT GGA TAA ATG ATG AGC TAA TTC CTG AAA TAA AA-3'； R2：5'-CCG CTC GAG TTA AGA ACA ATA TCT ATA TTT ACG-3'。特异性上游引物F1引入NcoⅠ酶切位点，特异性下游引物R2引入XhoⅠ酶切位点（下划线标注的为酶切位点）。

1.4 黏附因子基因的扩增、定点突变以SZWQ株基因组为模板。基因组的提取按照支原体基因组提取试剂盒说明书进行。按Simionatto等[5]介绍的定点PCR突变方法，将ORF内的密码子TGA突变成TGG。

1.4.1 分段扩增出黏附因子基因S1、S2 S1片段的扩增：上游引物F1 0.5 μL、下游引物R1 0.5 μL、模板1 μL、5×Buffer 5 μL、dNTPs 2 μL、DNA Ployesae 0.25 μL加水补体积至25 μL。PCR反应条件：95℃ 预变性5 min；95℃变性 30 s，52℃退火45 s，72℃延伸 1.5 min，32个循环；72℃再延伸10 min，16℃结束反应。反应产物分别使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并回收目的片段；S2片段的扩增：上游引物F2 0.5 μL、下游引物R2 0.5 μL、模板1 μL、5×Buffer 5 μL、dNTPs 4 μL、DNA Ployesae 0.25 μL加ddH2O补体积至25 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，32个循环；72℃再延伸10 min，16℃结束反应。反应产物分别使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并回收目的片段。

1.4.2 突变后黏附因子基因的扩增 上游引物F1 1 μL、下游引物R2 1 μL、模板1为S1片段1 μL、模板2为 S2片段1 μL、5×Buffer 10 μL、dNTPs 4 μL、DNA Ployesae 0.5 μL、加水补体积至50 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，48.8℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，32个循环；72℃再延伸10 min ，16℃结束反应。反应产物使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，回收目的片段。

1.5 突变后黏附因子重组蛋白的表达、可溶性鉴定和纯化将纯化后的PCR产物经酶切、连接克隆至pET-32a中，重组质粒pET32a-SZWQ-860进行双酶切和序列测定，筛选阳性重组质粒，将其转化到E.coliBL21(DE3)宿主菌中，并接种于含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、200 r/min震荡培养至OD值达到0.6时，加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG 30℃诱导4 h。离心收集100 mL菌体，悬于5 mL包涵体裂解液中，用反复冻融法及超声碎菌法破碎细胞，离心后取上清和沉淀分别与5×蛋白Loading buffer等量混匀，煮沸10 min后用SDS-PAGE进行可溶性鉴定。

将确定为可溶的目的蛋白用0.45 μm孔径的滤器过滤后，采用上海生工生物有限公司生产的Ni+层析柱对目的蛋白进行纯化，纯化后的蛋白进行SDSPAGE分析。

1.6 Western blot分析将纯化后的目的蛋白经SDSPAGE电泳后，用BIO-RAD系统将目的蛋白电转移至醋酸纤维素膜上，用 SZWQ株的高免兔血清（血清效价为1∶12 800）在4℃条件下进行一抗过夜孵育；洗膜，再用辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG在37℃温箱中进行二抗孵育2 h，辣根过氧化酶显色液（DAB）显色，观察结果。

2 结果与讨论

2.1 分离株黏附因子基因的定点突变及克隆以M.O内蒙古分离株（SZWQ株）的基因组为模板，S1片段扩增以F1和R1为引物，S2片段扩增以F2和R2为引物，进行PCR第一轮扩增，扩增出258 bp的S1片段和901 bp的S2片段；胶回收第一轮扩增产物，并以S1和S2片段为模板，F1和R2为引物，进行PCR第二轮扩增，扩增出突变后分离株黏附因子基因片段（SZWQ-860）。两轮扩增的结果经1%琼脂糖凝胶电泳分析，第一轮扩增结果分别在258、901 bp可见特异性条带，第二轮扩增结果在1159 bp可见特异性条带（图1），大小与理论值一致。

图1 SZWQ黏附因子基因 PCR产物Fig. 1 PCR product of SZWQ-860

经基因测序分析，SZWQ株的黏附因子基因中有一个密码子TGA，由于M.O和许多支原体都被证实用TGA编码色氨酸，而在一般细菌和原核（真核）表达系统中则是以TGG编码色氨酸，TGA作为终止密码子[5,6]，因此黏附因子基因在原核表达系统中不能正确表达，要获得正确的表达就需要通过体外突变才能实现。本研究将SZWQ株黏附因子基因中的TGA采用定点突变的方法将其突变为TGG，突变后测序结果表明，黏附因子的基因全长序列经定点同义突变后，889bp～891bp位点的TGA成功突变为TGG。

2.2 重组蛋白的表达、可溶性鉴定和纯化将重组质粒pET32a-SZWQ-860转化到 BL21（DE3）宿主菌中，对其进行诱导温度、诱导时间和IPTG浓度的摸索，最终确定在IPTG诱导浓度为0.4 mmol/L 、诱导时间为4 h、诱导温度为30℃的时候蛋白表达量最高，在约60 kDa处可见一条单一的条带（图2）。

将SZWQ株黏附因子的测序结果翻译为氨基酸序列，并与NCBI的蛋白数据库进行比对，显示其蛋白功能与猪肺炎支原体P102蛋白的功能极为相似。经预测，P102蛋白是猪肺炎支原体潜在的黏附因子，相关研究表明该蛋白具有一定的免疫活性[7]。微生物感染的第一步是黏附，故而对黏附因子的研究是研制绵羊支原体肺炎有效疫苗的途径之一。

2.3 Western blot分析重组蛋白经Western blot分析后，在约60 kDa处出现了反应条带，表明所表达的重组蛋白能够与SZWQ株高免兔血清发生特异性反应（图3）。经SDS-PAGE和Western blot分析表明该融合基因在原核细胞中成功的表达，并具有良好的免疫学活性和抗体结合活性，与前人报道相一致。该重组蛋白有望作为生物技术疫苗的候选蛋白，但其免疫保护性还有待进行研究。

图2 pET-SZWQ的IPTG诱导浓度Fig.2 pET-SZWQ induced with IPTG at different concentration

图3 目的蛋白的Western blot检测Fig. 3 Western blot analysis of target protein

[1] Mackya M K. Isolation of pleuropneumonia-like prganisma (Genus Mycoplasma ) from cases of sheep pulmonary adenomatosis (S.P.A) [J] . Vet Res, 1963, 75(21)∶ 550- 551.

[2] Carmicheal L E, George T D. Isolation , propagation for proliferative interstitial pneymonia [J]. Cornell Vet, 1972, 62 (4)∶ 654-679.

[3] Woubit S, Lorenzon S, Peyraud A,et al. A specific PCR for the indecencies of Mycoplasma capricious subsp.Caprineumiae the causative agent of contagious capricious pleuropneumonia (CCPP) [J].Vet Microbiol, 2004,1044(1-2)∶ 125-132.

[4] Dassanayake R P, Shanthalingam S, Herndon C N,et al. Mycoplasma ovipneumoniae can predispose bighorn sheep to fatal Mannheimia haemolytica pneumonia[J]. Vet Microbiol, 2010, 145(3-4)∶ 354-359.

[5] Simionatto S, Marchioro S B, Galli V,et al. Efficient site-directed mutagenesis using an overlap extension-PCR method for expressing Mycoplasma hyopneumoniae genes in Escherichia coli [J]. J Microbiol Meth, 2009, 79(1)∶ 101-105.

[6] 赵芝娜, 王桂珍. 肺炎支原体黏附因子及黏附相关蛋白的研究进展[J]. 中国人兽共患病杂志, 2004, 20(6)∶ 538-539.

[7] 郭丹, 陈红漫, 李媛, 等. 猪肺炎支原体P102基因的突变[J]. 畜牧兽医科技信息, 2009, (3)∶ 39-41.

SITE-DIRECTED MUTATIONS AND PROKARYOTIC EXPRESSION OF ADHESION MOLECULE OF MYCOPLASMA OVIPNEUMOIAE

CHENG Chen1, HUANG Hai-bi1, WANG Xiao-hui1, WANG Ren-chao1, XIE Hong-xia2, HAO Yong-qing1
(1. College of Veterinary Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. Animal Health Supervision of Sub-Bureau of Agriculture of Jiansanjiang, General Bureau of Land Reclamation of Heilongjiang Province, Jiamusi 156300, China)

In the present study, site-directed mutation technique was used to clone and express adhesion molecule gene (SZWQ-860) from an Inner Mongolia isolate SZWQ. The purif ed recombinant protein was visualized to be expected size of the target protein and perform specif c antibody-binding activity in Western blot.

Mycoplasma ovipneumoiae; adhesion molecule; site-directed mutation; recombinant protein

S852.62

B

1674-6422（2014）02-0083-04

2014-02-11

国家科技支撑计划（2011BAD18B01）

程晨，女，硕士研究生，预防兽医学专业

郝永清，E-mail：haoyq1960@163.com