含粘膜佐剂的鸡新城疫疫苗诱导雏鸡非特异性免疫应答的研究

殷秀辰，哈 卓，李 星，张清真，刘惠莉

（1. 上海市农业科学院畜牧兽医研究所 上海市农业遗传育种重点实验室，上海 201106；2. 上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106）

含粘膜佐剂的鸡新城疫疫苗诱导雏鸡非特异性免疫应答的研究

殷秀辰1,2，哈 卓1，李 星1，张清真1，刘惠莉1,2

（1. 上海市农业科学院畜牧兽医研究所 上海市农业遗传育种重点实验室，上海 201106；2. 上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106）

为研究分析重组大肠杆菌不耐热肠毒素（labile enterotoxin，LT）作为粘膜佐剂，配伍鸡新城疫疫苗的冻干样品对免疫鸡非特异性免疫应答的影响，在前期已经构建的LTR72/G192基础上，选择2、4 μg LTRG蛋白作为每羽份疫苗添加量，及降低新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV） 50%抗原量等配伍条件。按照生产条件制备冻干疫苗，进行雏鸡免疫试验，免疫后24、48、72 h采集脾脏、胸腺淋巴结，检测几种非特异性细胞因子表达水平。结果表明：IL-6、INF-γ水平在各疫苗免疫后24 h即升高，48 h达最高值；添加2、4 μg LTRG蛋白的NDV疫苗组IFN-β、TNF-α水平在48 h左右显著升高，其中含4 μg LTRG疫苗组与其他组差异具有极显著统计学意义（P＜0.01）；IL-6、IFN-γ转录水平有所增强，但各组间差异不具有显著统计学意义（P＞0.05），72 h左右几种细胞因子水平均迅速下降，与NDV疫苗接种组相近。由此可见，LTRG能辅助抗原诱导免疫雏鸡的非特异性免疫应答，有利于对感染病毒的清除。

LTRG；新城疫病毒；佐剂；细胞因子

大肠杆菌不耐热肠毒素（labile enterotoxin，LT）是产肠毒素大肠杆菌分泌的一种毒素蛋白，被认为是最具潜力的黏膜佐剂[1-3]。但LT的毒性限制了其应用，采用点突变可获得减毒甚至无毒的LT突变体，从而制备无毒LT蛋白[4]。

本实验室之前已经对LT进行了双突变体并成功表达了该蛋白，命名为LTRG（R72/G192），对重组蛋白的生物学特性、免疫佐剂活性进行了相关研究[5]，主要针对其与疫苗共免疫后的黏膜抗体IgA，血清抗体IgG的一些特异性免疫应答方面进行的评价。

非特异性免疫是机体在长期进化过程中与病原微生物相互作用，逐渐建立起来的一系列防御功能。宿主的抗病原应答反应强度与干扰素（interferon，IFN）及肿瘤细胞坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等细胞因子的浓度密切相关[6]。IFN是一种类似多肽激素的物质，具有广谱抗病毒和细胞调节功能的细胞因子。TNF是由巨噬细胞分泌的一种小分子蛋白，具有多种生物学功能，与抑制病毒复制、病毒颗粒的产生和感染性方面关系密切，并可杀伤病毒感染细胞[6,7]。白细胞介素（interleukin，IL）在免疫过程中也能够激活和调节免疫细胞，能够介导T、B淋巴细胞的活化、增殖及分化[8]。

本文采用LTRG蛋白与新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）活疫苗配伍免疫雏鸡，通过荧光定量PCR分别检测IFN、TFN以及IL-6的水平，研究LTRG对非特异性免疫应答的影响。

1 材料方法

1.1 材料新城疫活疫苗（NDV，LaSota）为上海海利公司生产，生产批号：1206016，病毒效价为109.75TCID50；冻干保护剂：10%牛奶保护剂，批号：20121129；LTRG蛋白为本实验室纯化保存，浓度为1 mg/mL。

1.2 试验方法

1.2.1 冻干样品制备 采用PBS将新城疫疫苗稀释，终浓度为2羽份/mL冻干疫苗1：NDV疫苗抗原与LTRG蛋白比例为1.5:4；冻干疫苗2：NDV疫苗抗原与LTRG蛋白比例为1.5:2；冻干疫苗3：NDV疫苗抗原与LTRG蛋白比例为1.5:4。

1.2.2 动物实验 50羽1日龄雏鸡饲养于消毒的洁净环境中，不接种任何疫苗及药物，至7日龄按表1分组，滴鼻免疫。

免疫后24、48、72 h每组分别处死2只鸡，采胸腺淋巴结和脾脏，用于检测细胞因子。

1.2.3 荧光定量PCR方法建立

1.2.3.1 引物设计及PCR体系和退火温度的筛选 根据GenBank中登录的鸡细胞因子IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-6核苷酸序列，选择保守序列区作为扩增区域，采用BLAST软件程序和Primer Premier 5.0软件设计引物，引物由上海生工生物工程公司合成，信息见表2。

表1 雏鸡试验分组Table 1 The group of chickens

表2 Real-time PCR 所用引物及产物片段长度Table 2 The primers used in Real-time PCR and length of fragment

通过优化各组分比例及退火温度等条件，建立PCR反应体系。20 μL反应液：模板1 μL、buffer 2 μL，上游引物终浓度为200 nmol/L，下游引物终浓度为200 nmol/L。

分别采用64.0℃、63.1℃、61.5℃、58.9℃、55.3℃、52.8℃、51.1℃和50.0℃ 8个温度梯度对Real-time PCR反应退火温度进行优化，确定最佳反应温度。

1.2.3.2 质粒标准品构建及标准曲线的建立 提取健康鸡脾脏RNA，采用设计的引物进行RT-PCR，扩增各细胞因子基因，回收克隆至T载体，经序列测定正确后，作为质粒标准品。

将质粒标准品稀释100倍，测定质粒浓度，并根据公式转化为测定样品中的质粒拷贝数。将拷贝数为2×108的质粒标准品进行10倍梯度稀释，共稀释5个梯度：2×108～2×103copies/μL。用优化的Realtime PCR反应体系扩增不同浓度模板绘制标准曲线。

1.3 Real-time PCR检测采用Trizol提取采集的鸡脾脏和胸腺淋巴结组织IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-6 RNA，加入DEPC水溶解后反转录，通过建立的Real-time PCR对其转录水平进行检测。采用优化的反应程序进行扩增。通过相对定量的分析，比较不同免疫组之间引起的细胞因子的组间差异表达。结果采用SPSS软件进行差异统计。

2 结果

2.1 最佳循环参数确定经优化，定量PCR扩增条件如下：95℃度预变性2 min；95℃ 变性15 s，57℃退火30 s，延伸30 s，40个循环。PCR仪于延伸阶段采集荧光信号。

2.2 细胞因子扩增与溶解曲线四种细胞因子扩增效果理想，扩增曲线均在理想循环参数内。溶解曲线重合率高，显示扩增目的基因均一性好（图1）。

2.3 胸腺淋巴结细胞因子检测对IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-6四种细胞因子检测发现，免疫后d 2，第一、二组细胞因子转录均明显上升，其中第一组配伍疫苗IFN-γ、TNF-α、IL-6与疫苗组差异具有显著统计学意义（P＜0.01）（图2）。结果表明，2、4 μg LTRG 均能促进细胞因子转录，增强非特异性免疫应答能力。

2.4 脾脏细胞因子检测雏鸡免疫后，检测脾脏细胞因子转录情况。结果发现，免疫后24 h，4 μg LTRG免疫剂量能显著增强IFN-β转录水平，与NDV对照组差异具有显著统计学意义（P＜0.05）；免疫后48 h，IFN-γ、IL-6 转录水平显著增强，高于2 μg LTRG添加组及NDV疫苗组，但差异不具有显著统计学意义（P＞0.05）；免疫后72 h，4 μg LTRG 添加疫苗组TNF-α转录水平显著升高，与NDV疫苗组差异具有显著统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图1 四种细胞因子扩增图Fig.1 The amplifi cation of four cytokines by Real-time PCR

3 讨论

佐剂（Adjuvant）是一类先于抗原或与抗原同时注入机体，从而非特异性地增强或者改变机体对抗原免疫应答的物质[9,10]。佐剂诱导抗原提呈细胞（APC）分泌细胞因子，可刺激CD4+T细胞分化为Thl与Th2两种亚型。其中Thl细胞可以分泌白细胞介素2 （IL-2）以及干扰素γ(IFN-γ)，促进B细胞特异性抗体IgG2的分泌，并介导细胞免疫应答。Th2细胞能够产生IL-4、IL-5、IL-6以及IL-10，以促进B细胞产生高水平的IgG和IgE[8,11]。

干扰素的主要作用是抗病毒及免疫调节[7]。研究证实，感染发生前，IFN-β有预防作用；感染发生后，IFN-β有治疗作用[12]。IFN-γ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。IFN-γ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用等，尤其是IFN-γ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能[13,14]。

图2 胸腺淋巴结细胞因子转录水平检测Fig.2 The detection result of the cytokines of thymus lymph node by Real-time PCR

图3 脾脏细胞因子定量检测Fig.3 The quantitative detection of the cytokines in spleens

本研究采用Real-time PCR对胸腺和脾脏的IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-6进行定量分析。结果表明，4种细胞因子在添加LTRG组中的转录情况要明显高于未添加组。胸腺中，4种细胞因子的水平在各疫苗免疫后48 h达最高值，含4 μg LTRG疫苗组与其他组差异具有极显著统计学意义（P＜0.01）。在脾脏中，含4 μg LTRG疫苗组与其他组差异具有极显著统计学意义，添加2 μg LTRG疫苗组与其他差异不具有极显著统计学意义。说明LTRG蛋白可以增强机体对疫苗的免疫应答能力，诱导各种细胞因子的表达显著增加。同时，细胞因子能够刺激B淋巴细胞的分泌抗体，较高的细胞因子能够刺激机体产生较高的抗体水平。本研究结果证明含有LTRG疫苗佐剂的新城疫疫苗能够刺激机体产生较高的非特异性免疫反应，对机体产生保护作用。

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ADDITION OF HEAT-LABILE ENTEROTOXIN AS ADJUVANT TO NEWCASTLE DISEASE VACCINE ENHANCES NON-SPECIFIC IMMUNE RESPONSES IN CHICKENS

YIN Xiu-chen1,2,HA Zhuo1,LI Xing1,ZHANG Qing-zhen1,LIU Hui-li1,2
(1. Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetic Breeding,Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Shanghai Academy of Agricultural Science,Shanghai 201106,China; 2. Shanghai Jiamu Bio-product Co. Ltd.,Shanghai 201106,China)

In the present study,heat-labile enterotoxin (LT) was used as adjuvants for Newcastle disease virus (NDV) vaccine to investigate if non-specifi c immune responses were enhanced in vaccinated chickens. The formulation procedure was to add 2 μg or 4 μg LTRG to one dose of NDV vaccine or 4 μg LTRG to half dose of vaccine followed by freeze-drying cycles. The aduvanted NDV vaccines were orally administered to chickens. At 24,48 h and 72 h post vaccination,spleens,thymuses and lymph nodes were collected and levels of IL-6,INF-γ,IFN-β and TNF-α were detected in Real-time PCR. The results showed that IL-6 and INF-γ of all vaccinated chickens started to rise at 24 h and peaked at 48 h post vaccination while IFN-β and TNF-α did not signifi cantly increase till 48 h post vaccination.In addition,chickens vaccinated with NDV vaccine containing 4 μg LTRG developed significantly (P＜0.01) higher IL-6 and INF-γ responses than NDV alone controls. The transcription levels of IL-6 and INF-γ increased but difference among groups was not signifi cant (P＞0.05). In conclusion,addition of LTRG to NDV vaccine enhanced non-specifi c immune responses in vaccinated chickens.

LTRG; Newcastle disease virus; adjuvant; cytokines

S852.659.5

A

1674-6422（2014）05-0035-06

2014-07-05

上海市科委农业成果转化项目（1239019N0800）；上海市农委攻关项目（沪农科攻字(2008)第8-6号；沪农科攻字(2010)第2-4号）

殷秀辰，男，硕士，主要从事病毒分子生物学和免疫学的研究

刘惠莉，E-mail：huilil@163.com