亚甲基四氢叶酸还原酶基因C667T多态性与冠状动脉慢血流现象的关系研究

吴坚 唐欧杉 秦丰明 成银宏 陈钟良 陈丽娜 周浩亮 陶枫 童海江

亚甲基四氢叶酸还原酶基因C667T多态性与冠状动脉慢血流现象的关系研究

吴坚 唐欧杉 秦丰明 成银宏 陈钟良 陈丽娜 周浩亮 陶枫 童海江

目的 观察亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因C677T多态性与中国南方汉族人群中冠状动脉慢血流现象（CSFP）的关系，进一步探讨遗传因素在CSFP发病中的意义。方法收集经冠状动脉血管造影证实冠脉正常的患者214例作为研究对象，并利用校正的TIMI帧数法（CTFC）分组为慢血流组（143例）和对照组（71例），应用焦磷酸测序法（Pyrosequencing）检测患者C677T基因表型，分析MTHFR基因C677T多态性与CSFP的关系。结果慢血流组MTHFR基因（TT+TC）基因型和T等位基频率均明显高于对照组（69．2%、49．3%，χ2=8．05，P＜0．01；42．7%、29．6%，χ2=6．87，P＜0．01），慢血流组男性比例明显高于对照组（59．4%、36．6%，χ2= 9．90，P＜0．01），同型半胱氨酸(Hcy)和尿酸(UA)水平明显高于对照组（P＜0．05或0．01），慢血流组叶酸(FA)和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平明显低于对照组（P＜0．05），Logistic回归分析均显示（TT+TC）基因型[OR=1．962，95%CI（1．049～3．669），P＜0．05]、Hcy水平升高 [OR=1．087，95%CI（1．012～1．168），P＜0．05]、男性 [OR=2．507，95%CI（1．347～4．664），P＜0．01]和UA水平升高[OR=1．008，95%CI（1．003～1．013），P＜0．01]患者CSFP发病风险增加。结论MTHFR基因C677T多态性与CSFP发病相关，携带T等位基因可能是中国南方汉族人群冠状动脉慢血流现象发病的危险因素之一。

冠状动脉慢血流现象 同型半胱氨酸 同型半胱氨酸代谢相关酶 基因多态性

冠状动脉慢血流现象（coronaryslow flow phenomenon，CSFP）被定义为一种在冠状动脉造影中没有发现心外膜冠状动脉存在明显狭窄病变，而对比剂灌注远端血管延迟的现象。最早由Tambe等[1]在1972年报道了6例存在该现象的典型心绞痛患者。虽然截止目前关于该现象的研究数量有限，但主流观点认为微血管功能障碍是引发该现象的主要原因，而具体引起血管功能异常的因素尚处于不断探索阶段。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）作为一种含巯基氨基酸，在巯基氧化过程中产生具有内皮毒性反应的活性氧产物，损伤内皮细胞功能，而高Hcy血症已被认为是心血管相关疾病的独立危险因素，现已有少量研究[2-3]发现Hcy水平升高可能是CSFP发病的危险因素之一，而亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸和Hcy代谢的一个关键酶。本研究通过观察研究对象中MTHFR基因C677T多态性，分析其与CSFP的关系，进一步探索遗传性因素在发病中所起作用。

1 资料和方法

1.1 一般资料 2011-06—2013-06在我院因疑诊冠状动脉粥样硬化性心脏病而行冠状动脉血管造影证实冠脉正常的患者214例作为研究对象，均为绍兴地区及其邻近区域汉族人，按校正的TIMI帧数法（CTFC）分为慢血流组143例和对照组71例。排除标准：充血性心力衰竭、心脏瓣膜性疾病、限制型心肌病、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、房室传导异常、冠脉痉挛、冠脉瘤样扩张、冠脉弥漫性病变、正服用抗凝或抗血小板凝聚药物、慢性肺部疾病、严重肝肾功能不全、结缔组织疾病及可引起高血浆Hcy的相关疾病或在服用相关影响药物。

1.2 冠状动脉血流测量方法 应用PHILIPS Allura Xper FD20数字血管造影机，采用Judkins法，左前降支（LAD）、左回旋支（LCx）采集体位为右前斜30°，右冠状动脉（RCA）取左前斜50°，采集速度为15帧/s。按Gibson等[2]描述的CTFC由2位介入医师分别观察记录血流帧数，结果取均值。记录帧数以30帧/s校正。本研究慢血流入选标准：血管造影正常，任一血管血流帧数＞27（其中LAD血流帧数除以1.7校正）。

1.3 MTHFR基因型测定 采用生工生物（上海）有限公司的血液基因组DNA快速抽提试剂盒提取基因组DNA。参照 GenBank中 MTHFR基因序列，利用PRIMER5.0软件设计包含C677T多态性位点的PCR引物：上游引物5′-TCA TCC CTA TTG GCA GGT TAC-3′，下游引物5′-CAA AGC GGA AGA ATG TGT CA-3′，测序引物5′-GAG AAG GTG TCT GCG GGA-3′，其中下游引物5′末端进行生物素标记；PCR反应体系总体积为50μl，含5×Green Gotaq reaction Buffer 10μl，MgCl2（25mM）6μl，引物各0.5μl，dNTPs 1μl，TagDNA聚合酶1U，余用ddH2O补全。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃延伸1min，16℃，终止反应。利用PyroMark Q96 ID焦磷酸测序仪进行PCR产物的焦磷酸测序。生物素及PCR反应体系均为Promega公司产品。

1.4 临床检验数据测定 所有患者在禁食至少8h基础上抽取外周静脉血进行相关指标检测。空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、肌酐（Cr）、尿酸（UA）、Hcy均采用OLYMPUS AU2700+ISE大型全自动生化分析仪测定，其中Hcy测定采用循环酶法；纤维蛋白原（FIB）测定采用免疫比浊法；叶酸（FA）测定采用固相放免法；平均血小板体积（MPV）测定采用Coulter LH750血细胞分析仪。

1.5 心脏超声指标测定 利用西门子SEQUOIA 512彩色多普勒采集系统测定患者左室舒张末内径（LVEDd）和左室收缩功能（LVEF）。

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件，连续性正态分布计量资料用表示，组间比较采用t检验，非正态分布连续计量资料采用M（QR）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。组间计数资料比较采用χ2检验。利用Pearson相关分析连续性变量间的相关性，而分类变量采用Kendall’s tau-b方法。以是否为慢血流患者为应变量，作多元逐步Logistic回归分析（向后：Wald法），对CSFP影响因素进行筛选。应用拟合优度χ2检验分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2 结果

2.1 两组患者的基础临床资料比较 见表1。

表1 两组患者的基础临床资料比较

由表1可见，两组患者年龄、吸烟、饮酒、高血压病、糖尿病、收缩压及舒张压差异均无统计学意义（均P＞0.05），而慢血流组男性比例显著高于对照组（P＜0.01）。

2.2 临床检测数据及CTFC比较 见表2。

由表2可见，两组患者TG、TC、LDL-C、FBG、Cr、FIB、MPV、LVEF、LVEDd无统计学差异，慢血流组Hcy高于对照组（P＜0.05），UA高于对照组（P＜0.01），HDLC、FA低于对照组（P＜0.05）。慢血流组3支血管CTFC均显著高于对照组（P＜0.001），两组患者平均CTFC分别为37.6（32.3，45.5）和22.2（20.3，23.4）（P＜0.001）。2.3 MTHFR基因型比较 根据焦磷酸测序仪结果判断基因型（图1），慢血流组中CC、CT和TT基因型的频率为30.8%、53.1%和16.1%，对照组中为50.7%、39.4%和9.9%，各组基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=1.067、0.202，P＞0.05）。其中慢血流组TT+ TC型频率和T等位基因频率均显著高于对照组（χ2= 8.05、6.87，P＜0.01），详见表3。

表2 两组患者临床检测数据及CTFC比较

表3 两组患者基因型和等位基因频率比较

2.4 单因素相关分析 平均CTFC与Hcy（r=0.380，P＜0.001）、男性（r=0.331，P＜0.001）、TT+TC基因型（r= 0.176，P＜0.05）和饮酒（r=0.169，P＜0.05）呈正相关、与FA（r=-0.315，P＜0.001）呈负相关；Hcy与TT+TC型呈正相关（r=0.171，P＜0.05），与FA呈负相关（r=-0.508，P＜0.001）。

2.5 多元逐步Logistic回归分析 以慢血流与否为应变量，应用单因素分析筛选出Hcy、性别（男性=1，女性= 0）、基因型（TT或TC=1，CC=0）、HDL-C、FA、UA进入逐步回归分析，结果示TT+TC基因型、Hcy、男性、UA与CSFP发病相关，详见表4。

图1 MTHFR C677T基因型焦磷酸测序结果（a）为CC基因型（b）为TT基因型（c）CT基因型

表4 CSFP发病影响因素的Logistic回归分析

3 讨论

截至目前尚没有一个明确的机制来阐述冠状动脉慢血流现象是如何发生的，而冠脉微血管功能失调被认为与CSFP有关。1996年Mangieri等[4]对慢血流患者的左室心肌活检进行了研究后发现细胞水肿、毛细血管损伤和微血管管腔变小，进一步电镜发现细胞核形态不规则，核浆固缩等现象，他们推测以上改变使得远端血流阻力增加从而导致了血流减慢，支持了微循环阻力升高是慢血流现象主要原因的假说。Sezgin等[5]研究发现，CSFP患者存在内皮功能失调，血浆一氧化氮（NO）水平和血流介导的血管扩张较正常对照组显著降低，可见血管内皮细胞的功能在冠脉微循环调节中也起到重要作用，故有相当数量的研究围绕内皮细胞功能展开，Tanriverdi等[6]发现CSFP患者丙二醛、超氧化物歧化酶水平增高，还原型谷胱甘肽水平减低，证实了高Hcy所致的高氧化应激反应损伤血管内皮功能，可能在CSFP发病中起一定作用。现有证据已经明确Hcy可通过高氧化应激反应直接损伤血管内皮功能，同时Hcy可抑制一氧化氮合酶的合成和活性、抑制L精氨酸的转运，从而减少NO的生成，使NO降解增加，引起微血管舒张功能减退。本研究结果也同样显示，慢血流组Hcy水平明显高于正常血流组。而多元逐步Logistic回归分析也同样显示Hcy是CSFP发病的危险因素之一。本研究的发现男性比女性更易发生CSFP，与Hawkins和Nie等[7-8]研究相同。Camsari等[9]借助超声和IVUS发现CSFP患者冠脉存在弥漫性内膜增厚和（或）节段性钙化，冠脉内膜平均厚度均较对照组明显增加。故这些学者认为CSFP为早期动脉粥样硬化的一种表现形式。同时发现UA可能是CSFP发病的预测因素之一，与Yibliz等[10]研究结果相同。虽然慢血流组HDL-C较对照组明显减少，与戴宇翔等[11]研究结果相同，多元回归分析未支持其与CSFP发病相关。

已有研究发现MTHFR基因存在多种突变类型，而C677T基因多态性是学者研究最多的，它是目前发现的MTHFR基因最常见的不耐热错义突变，不易受外界环境的影响，是单核苷酸多态性位点。MTHFR C677T突变使其活性下降，热敏感性增高，从而使Hcy转硫基和甲基化过程出现障碍而诱发Hcy升高。Arai等[12]的研究证实，TT基因型个体有较高的血浆Hcy水平。现有数据表明MTHFR基因C677T基因多态性可能与多种疾病发病相关，其中就包括冠心病。欧洲9个国家一个协作项目对711例心血管患者和747例对照者进行的研究表明，特别是当血浆Hcy升高和叶酸降低时，MTHFR基因C677T突变T纯合基因型是心血管疾病的风险因子[13]，而目前针对MTHFR基因突变与CSFP的相关性尚无文献报道，本研究发现慢血流组TT+TC型频率要显著高于对照组[OR=2.314，95%CI（1.289～4.155）]，T等位基因频率也高于对照组[OR=1.771，95%CI（1.152～2.722）]。进一步Logistic回归分析同样证明T等位基因携带者CSFP发病率增高 [OR=1.962，95%CI（1.049～3.669）]，表明携带T等位基因可能是CSFP发病的危险因素之一。

本研究虽然发现MTHFR基因C677T多态性可能是CSFP发病的危险因素之一，但未入选如BMI等已知及其他未知的可能影响因素，有待进一步研究作出解答报道。

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Association of MTHFR polymorphisms with risk of coronary slow flow phenomenon

Objective To investigate the association of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)C677T polymorphisms with risk of coronary slow flow phenomenon(CSFP)．MethodsOne hundred and forty three patients with CSFP and 71 controls were included in this study．CSFP were diagnosed by the corrected TIMI frame count method．The polymorphisms of MTHFR C677T were determined by pyrosequencing in two groups．ResultsThe TT and TC genotype frequency,and T allele frequency in CSFP patients were higher than those in the controls(69．2%,49．3%,χ2=8．05,P＜0．01;42．7%,29．6%,χ2=6．87,P＜0．01)．Male to female ratio was higher in CSFP group(59．4%,36．6%,χ2=9．90,P＜0．01)than in controls．Serum homoeysteine (Hcy)and uric acid(UA)levels were higher,folic acid and high-density lipoprotein cholesterol levels were lower in CSFP patients than those in controls(P＜0．05 and 0．01)．After other risk factors were adjusted,TT and TC genotype(OR=1．962,95%CI 1．049～3．669,P＜0．05),Hcy(OR=1．087,95%CI 1．012～1．168,P＜0．05),male sex(OR=2．507,95%CI 1．347～4．664,P＜0．01)and UA (OR=1．008,95%CI 1．003～1．013,P＜0．01)were independent risk factors for CSFP．ConclusionThe high frequency of allele T in MTHER gene C677T may be a risk factor for CSFP in the southern Chinese population．

Coronary slow flow Homocysteine Homocysteine metabolism related enzymes Gene polymorphism

2014-04-14）

（本文编辑：田云鹏）

浙江省医学会临床科研基金项目（2011ZYC-A90）

312000 绍兴第二医院心血管内科

唐欧杉，E-mail：tangoushan@medmail.com.cn