p38MAPK与ERK1/2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

邹俊勇 陆国华 周建英 周建娅

●论 著

p38MAPK与ERK1/2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

邹俊勇 陆国华 周建英 周建娅

目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员p38MAPK、细胞外信息调节蛋白激酶（ERK1/2）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及临床意义。 方法 选取43例NSCLC的肿瘤组织及其癌旁正常组织作为对照。采用蛋白免疫印迹法检测p38MAPK、ERK1/2的表达情况，分析其与临床特征（包括性别、年龄、肿块大小、淋巴结转移情况、分化程度、组织类型以及病理分期）的关系，及其表达程度与预后的关系。 结果 与配对的正常肺组织比较，phospho-p38MAPK、phospho-ERK1/2在NSCLC组织中活化上调（均P＜0．01），43例患者中37例phospho-p38MAPK的表达平均增长2．95倍，39例phospho-ERK1/2表达平均增长3．07倍，差异均有统计学意义（均P＜0．01）。ERK1/2的表达与各临床特征均无明显相关（均P＞0．05），而p38MAPK的活化与肿瘤大小以及年龄相关（均P＜0．01）。ERK1/2未活化组、中度活化组与高度活化组的生存曲线依次下移，p38MAPK高度活化组生存曲线明显降低。Cox比例风险回归模型分析显示，phospho-p38MAPK的高表达是预后不良的预测因素（P＜0．05）。 结论 p38MAPK与ERK1/2的活化表达可能在NSCLC的发生/发展过程中具有重要意义，其中p38MAPK的活化程度可辅助作为非小细胞肺癌的预后评估因素。

丝裂原活化蛋白激酶 p38MAPK ERK 非小细胞肺癌 预后

肺癌是临床上最常见的实体肿瘤，随着吉非替尼等 一批肺癌靶向药物进入临床，非小细胞肺癌尤其是腺癌患者受益，无进展生存期明显延长。但随之出现的耐药现象及有限延长的总生存期促使临床更深入探究肺癌的发生、发展机制及寻求新的分子靶点。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族广泛分布于真核细胞中，主要有p38MAPK、C-Jun N-末端激酶/应激活化蛋白激酶（c-jun N-termina1 kinases/stress-activated protein kinase，JNK/SAPK）和细胞外信息调节蛋白激酶（extrace11u1ar signa1-regu1ated kinases 1and 2，ERK1/2）3个主要成员。MAPK通路是一条重要的联接细胞外刺激与细胞内生物学变化的信号通路，通过MAPK通路，可以影响染色体结构以及转录因子的活性，从而产生一系列广泛而重要的生物学效应，包括炎症、细胞生长、增殖、分化、细胞周期停止、凋亡等。本研究通过检测非小细胞肺癌（non-sma11 ce11 1ung cancer，NSCLC）患者p38MAPK、ERK1/2与JNK的表达情况，分析其与NSCLC临床及病理特征的关系，旨在探讨其表达及临床意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2006-08-11在浙江大学医学院附属第一医院手术的43例NSCLC患者的肿瘤组织标本，患者男32例，女11例，年龄37～77（62.09±8.76）岁。以离肿瘤边缘5cm以上且病理证实无癌细胞浸润组织为正常肺组织作为对照。肿瘤组织切下后立即放入液氮中并储存于-79℃的低温冰箱中。采用电话及门诊方式随访，总生存时间定义为从手术之日至任何原因引起的死亡或者至随访的终点，随访截止时间为2012-11-30，43例患者中有5例失访，其余38例完成了6年随访。

1.2 试剂与仪器 一抗1∶500～1∶1 000稀释，抗phospho-p38MAPK抗体（Tyr-182），抗phospho-JNK1/2抗体（Thr-183、Thr-185），抗phospho-ERK1/2抗体（Thr-160、Thr-177），β-actin抗体，均购自美国SANTA CRUZ公司。二抗（1∶1 000稀释）：驴抗小鼠以及驴抗兔的特异性二抗，购于美国SANTA CRUZ公司。垂直电泳、转膜设备以及Ge1 Doc EQ成像分析系统均购自美国BIORAD公司。

1.3 方法 采用PBS缓冲液洗净组织，称取组织0.2g，剪刀剪碎后放入玻璃管，加入1m1裂解液，置于冰上，用自动匀浆机将组织细胞破碎。将裂解液回收入1.5m1 Eppendorf管中。在冰上颠倒混匀，3～5min/次，共5次，然后在4℃下12 000g离心15min，离心后留上清液，即为蛋白提取液，分装备用。用Lowry法测定蛋白浓度，根据最低标本蛋白浓度，用PBS稀释至相等浓度，加等量的2×样品上样缓冲液，在100℃沸水中煮沸5min，上样电泳。取50μg蛋白上样到15%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（100V，1.5h），并转到PVDF膜上（300V，2h）用5%的脱脂奶粉室温下封闭2h，一抗4℃振摇孵育过夜，二抗室温孵育2h后用ECL显色系统显影，凝胶成像分析。结果用Quantity One 1-D分析软件进行分析，软件自动勾勒目标条带周边，计算选定区域内信号强度的总和，以此信号强度代表蛋白的相对表达量。以βactin作为内参，校正上样量的误差。

1.4 统计学处理 采用SPSS Statistic 19统计软件，计量资料以表示，自身对照比较采用配对t检验。不同临床特征者p38MAPK和ERK1/2的表达量的比较采用两独立样本t检验。采用Kap1an-Meier法绘制生存曲线，p38MAPK和ERK1/2的表达与预后的关系采用Cox比例风险回归模型进行分析。

2 结果

2.1 phospho-p38MAPK、phospho-ERK1/2的表达情况 见图1-2。

图1 phospho-p38MAPK、phospho-ERK1/2、phospho-JNK1/2上样电泳图（T：肿瘤组织，N：自身对照的正常肺组织）

由图1可见，与配对的正常肺组织比较，phosphop38MAPK、phospho-ERK1/2在NSCLC组织中活化上调，差异均有统计学意义（均P＜0.01），而JNK的表达并无明显差异（P＞0.05）。由图2可见，43例患者中37例 phospho-p38MAPK的表达增高，39例 phospho-ERK1/2表达增高，与配对肺组织比较，phosphop38MAPK平均增长2.95倍，phospho-ERK1/2平均增长3.07倍，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

2.2 p38MAPK及ERK1/2的表达与临床特征的关系 见表1。

图2 Quantity One 1-D软件分析结果

由表1可见，不同临床特征者ERK1/2表达的差异无统计学意义，而在不同年龄、肿瘤大小者之间p38MAPK表达的差异有统计学意义。

2.3 NSCLC患者生存曲线及p38MAPK和ERK1/2的表达与预后的关系 根据表达程度将p38MAPK和ERK1/2分层为未活化组（p38MAPK或ERK1/2活化表达未升高或降低）、中度磷酸活化组（活化表达升高＜2倍）及高度磷酸活化组（活化表达升高＞2倍）。3组患者生存曲线的比较见图3。

由图3可见，ERK1/2未活化组、中度活化组与高度活化组的生存曲线依次下移，p38MAPK高度活化组生存曲线明显降低。Cox比例风险回归模型分析显示，phospho-p38MAPK的高表达是预后不良的预测因素（P＜0.05）。

3 讨论

外界刺激作用于细胞的信号，从胞膜传递到胞浆及胞核，最终引起广泛的细胞效应的途径是一个多种细胞因子参与、逐级磷酸活化、瀑布样放大的过程。MAPK是许多细胞膜信号传导途径的共同通路，通过对MAPK活性的调控，可以达到调节基因表达、有丝分裂、新陈代谢、细胞凋亡与分化等功能[1]。

表1 p38MAPK及ERK1/2的表达与临床特征的关系

图3 p38MAPK、ERK1/2未活化组、中度活化组及高度活化组的生存曲线

本研究结果显示，p38MAPK和ERK1/2在NSCLC中特异性激活，且p38MAPK的活化受到肿瘤大小及患者年龄的影响。p38MAPK和ERK1/2的异常活化表达提示这两个因子可能在NSCLC的发生及发展过程中发挥重要作用。而p38MAPK的活化与肿块的大小之间的关系也侧面印证了p38MAPK因子在肿瘤生长时的促进作用。p38MAPK的活化程度随患者年龄增大而增加，提示在老年患者中，包括p38MAPK在内的某些致癌因子可能相对活跃。p38MAPK和ERK1/2高度活化的NSCLC患者生存曲线均下移，并有统计学意义，phospho-p38MAPK的高度活化表达是预后不良的预测因素。这些结果可能与MAPK抑制肿瘤细胞凋亡及促进肿瘤转移的作用密切相关。另外发现病理分期及低分化与预后不良可能相关，但未达到统计学意义，可能与本次研究样本量较小相关。童向东等[2]对71例NSCLC手术标本进行了免疫组化分析，发现p38MAPK和ERK1的表达与肺癌分期有关，p38MAPK阳性表达的肺癌患者预后较差。这个研究与我们的结果有一定的一致性，提示我们p38MAPK与ERK1/2可能在总量及磷酸化活化表达两个层面上均有提高，并推进了肿瘤的发生发展。

另外，MAPK家族的另一个重要因子JNK，在NSCLC中无明显活化，说明不同的MAPK因子在同一肿瘤中的作用并不一致，各种因子的作用是复杂而有差异的。以往研究已经表明相同MAPK因子在不同类型肿瘤细胞中所起的作用也并不相同。研究发现，桔梗皂甙D可通过激活p38MAPK和JNK来抑制人胃癌细胞[8]，而更多的研究发现MAPK在诸如黑色素瘤[9]、胰腺癌[10]等肿瘤中发挥促进肿瘤发生的作用，这些结果提示MAPK的作用有细胞特异性，而这特异性可能来源于两个原因：（1）MAPK各因子都有多个亚型，这些亚型有不同分布，不同表达程度，有不同的底物和各自特异性，所以它们可以在不同肿瘤中导致不同的结果。（2）MAPK有许多底物，这些底物之间作用可以不同，甚至截然相反。而不同类型和程度的刺激就可能导致不同底物的活化，从而产生不同的生物学效应。这也提示未来进一步深入的研究可以着眼于建立一个MAPK途径效应与不同刺激之间的量效联系。当然，MAPK活化导致的细胞效应的细胞种类特异性也应引起重视。

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Expression of phospho-MAPK in non-small cell cancer and its clinicopathological significance

ObjectiveTo examine the expression of phospho-p38MAPK,phospho-JNK,and phospho-ERK1/2 in non-small cell lung cancer(NSCLC)and its clinicopathological significance． Methods Forty-three specimens of primary non-small cell lung cancer and paired normal lung tissue were collected．The expressions of phospho-p38MAPK,phospho-ERK1/2 and phospho-JNK were detected with Western-blot analysis．The association between clinicopathological parameters and the expression of phospho-p38MAPK and phospho-ERK1/2 protein was analyzed．Results Compared with corresponding normal lung tissue,the expression of phospho-p38MAPK and phospho-ERK1/2 in NSCLC tissue were increased (P＜0．01)．In 37 cases,phospho-p38MAPK expression were increased by average 2．95 times(P＜0．01),while in 39 cases phospho-ERK1/2 expression were increased by 3．07 times(P＜0．01)．The expression of ERK1/2 was not correlated with clinicpathological parameters(P＞0．05)．The activation of p38MAPK was correlated with tumor size and ages of patients(both P＜0．01)．The expressions of ERK1/2 and p38MAPK were negatively correlated with survival．Multivariate analysis revealed that the expression of phospho-p38MAPK was an independent prognostic indicator for overall survival of patients (P=0．046)． Conclusion ERK1/2 and p38MAPK are activated in NSCLC,and the expression of phospho-p38MAPK can help to predict the prognosis of NSCLC．

MAPK p38MAPK ERK NSCLC Prognosis

2014-01-20）

（本文编辑：欧阳卿）

国家自然科学基金资助项目（81101768）；浙江省科技厅重大科技项目（2012C13G2010111）

310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院呼吸内科（邹俊勇现在宁波市第二医院工作）

周建英，Email：zjyhz@zju.edu.cn