曲古抑菌素A对博莱霉素致肺纤维化小鼠新生血管的影响

黄旭晴 施长春 李旭 陈刚

曲古抑菌素A对博莱霉素致肺纤维化小鼠新生血管的影响

黄旭晴 施长春 李旭 陈刚

目的 探讨组蛋白脱乙酰基转移酶抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠的新生血管的影响。方法120只雄性C57BL/6小鼠随机分为控制对照组（CG）、肺纤维化模型组（MG）、TSA早期处理组（EG）和TSA晚期处理组（LG）。MG、EG、LG予以博莱霉素溶液10mg/kg气管内注射建立小鼠肺纤维化模型，CG予以等体积0．9%氯化钠溶液注射。TSA处理组在造模后分两个阶段（早期：第1～14天；晚期：第15～28天）予以TSA溶液40 mg/kg腹腔内注射，每周2次；CG和MG则予以等体积二甲基亚砜（Dmso）腹腔注射。各组于造模后第7、14、28天分三批处死，观察肺组织大体，行HE和Masson染色，Szapiel评分，测定羟脯氨酸（HYP）含量，免疫组化检测血管内皮生长因子（vascular endothelial groth factor，VEGF）。结果小鼠造模均成功：CG小鼠未见蓝色胶原沉积；MG小鼠可见蓝色胶原沉积明显；并随着小鼠生存时间延长，蓝色胶原沉积加重，EG小鼠可见蓝色胶原沉积介于CG组与MG组之间；LG组蓝色胶原沉积较EG更重。与CG组比较，其他各组各时点HYP含量及VEGF的IOD值均发生显著变化（均P＜0．01）；与MG组比较，EG组第7、14、28天HYP含量均显著降低（均P＜0．01）；与EG组比较，LG组第7、14、28天HYP含量均显著升高（均P＜0．01）。与MG组比较，EG组第7、14、28天VEGF的IOD值均发生显著变化（均P＜0．01）；与EG组比较，LG组第7、14、28天VEGF的IOD值均显著升高（均P＜0．01）。结论早期予以TSA可以抑制博莱霉素致肺纤维化小鼠新生血管形成，减轻肺间质纤维化，晚期干预则没有明显作用。

组蛋白脱乙酰基转移酶抑制剂 肺间质纤维化 新生血管

目前，肺纤维化仍存在发病机制不清，表现复杂，治疗效果不理想等问题。特发性肺纤维化为慢性进行性发展的致死性疾病，预后差，中位生存期为2～2.8年，糖皮质激素/和免疫抑制剂等常规治疗措施有效率不足30%[1]，严重威胁人类健康。因此，拓展新的治疗措施具有重要意义。研究证实，新生血管形成在肺纤维化过程中发挥重要作用[2]。血管内皮生长因子（VEGF）是强烈而高度特异性的血管内皮有丝分裂原，在新生血管形成中起重要作用，其表达与新生血管形成呈正相关。VEGF可能通过与特异性受体结合促进成纤维细胞生长合成胶原等细胞外基质进一步导致肺纤维化[3]。VEGF信号途径在新生血管形成居于主要地位[4]。曲古抑菌素A（TSA）为链霉菌代谢产物，是一种组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂。TSA已被报道可以抑制低氧或VEGF诱导的新生血管形成[5-6]。本研究以博莱霉素（bleomycin，月LM）致肺纤维化小鼠模型[7-8]为实验对象，旨在探讨TSA对月LM诱导肺纤维化小鼠的新生血管的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 实验动物：健康清洁级C57月L/6小鼠120只，6～8周龄，体重18～22g；购于南京君科生物工程有限公司。试剂：羟脯氨酸（HYP）检测试剂盒购于南京建成生物研究所，TSA购自Sigma公司，月LM购自哈尔滨博莱制药有限公司，VEGF试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。

1.2 动物分组与造模 将小鼠随机法分为4组，每组30只。CG组：第1天气管内注入0.9%氯化钠溶液0.15ml；MG组：第1天气管内注入10mg/kg月LM及腹腔注射0.9%氯化钠溶液15ml；EG组：气管内第1天注入月LM及第1～14天腹腔注射TSA（40mg/kg）；（4）LG：第1天腹腔注入月LM剂量及第15～28天腹腔注射TSA（40mg/ kg）。实验小鼠颈正中切口、钝性分离浅筋膜逐层暴露气管；MG、EG及LG组小鼠每只按5mg/kg一次性快速气管内注入月LM 0.15ml，CG组小鼠每只气管内注入0.9%氯化钠溶液0.15ml；直立、轻轻、快速地旋转动物约2min，使药物尽可能均匀分布于气管、支气管和双肺。局部酒精消毒，缝合伤口。EG及LG组小鼠在造模后分两个阶段（早期：第1～14天；晚期：第15～28天）予以TSA（40mg/kg）腹腔内注射（2次/周）作为治疗干预；CG和MG组小鼠同时间点予以等体积二甲基亚砜（DMSO）腹腔内注射作为对照。

1.3 检测方法

1.3.1 肺组织HE和masson染色 在光镜下观察小鼠肺组织大体，Masson染色进行胶原纤维及肌纤维的鉴别，以此确定建模是否成功。

1.3.2 肺泡炎及肺纤维化程度评定 采用Szapiel等[9]报道的方法评定，将肺纤维化分为（-）～（+++）级：（-）级：正常肺组织，无纤维化，评0分；（+）级：轻度纤维化，受累面积＜20%，纤维化累及胸膜、胸膜下肺间质，肺泡结构发生紊乱，评1分；（++）级：中度纤维化，病变范围约占全肺20%～50%，肺纤维化区域从胸膜开始延伸，但仍属局部性，评2分；（+++）级：重度纤维化，病变范围＞50%，并有融合，可见大小不等的囊气腔，并伴有广泛肺实质结构紊乱，评3分。

1.3.3 肺组织匀浆HYP检查 准确称取保存备用的湿肺组织30～40mg/只，剪碎后制成匀浆，采用硷水解法测定样本光密度，然后根据光密度和肺组织重量计算HYP含量，具体操作严格试剂盒说明书进行。

1.3.4 VEGF测定 采用免疫组化SP法，切片皆采用图像分析软件先进行颜色分离，然后自动计算其光密度（IOD）值进行半定量分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件，所得数据均以表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 4组小鼠肺组织肉眼观病理变化比较 CG组小鼠正常肺组织弹性回缩良好，呈粉红色，湿润、表面光滑；MG组小鼠第7天时双肺呈暗红色病灶中可见较多点状，第14天时双肺出现较多片状白色区域，肺容积开始降低，第28天时肺组织呈苍白色泽，肺体积明显缩小，硬度增加，弹性降低，仍旧可见散在的细小出血点，表面凹凸不平，弹性明显降低；EG组小鼠第28天时肺部湿润、有弹性、表面光滑，体积缩小不明显，弹性尚好，表面轻微结节样改变；LG组小鼠第28天时病变与MG组小鼠相似。

2.2 4组小鼠肺组织显微镜下病理形态比较 MG组小鼠第7天肺泡腔、肺间质内有大量的多核及单核细胞浸润，表现为肺泡炎及肺间质炎症，可见大量新生血管形成，第14天时损伤改变分布不均匀，以胸膜下区明显，肺泡间隔轻度增宽、巨噬细胞等炎性细胞浸润明显、胶原纤维沉积少，第28天时肺组织肺泡炎仍较重，并开始出现纤维化改变，新生血管减少，破坏严重、纤维化明显、少见炎性细胞浸润。与MG组比较，EG组小鼠第7、14、28天时炎症和纤维化均不明显；LG组小鼠相关指标无明显改善，第7、14天时仍出现明显巨噬细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润和纤维化改变，第28天时肺组织结构破坏明显、炎性细胞浸润减少，而间质大量胶原沉积。

2.3 Masson染色结果 小鼠造模均成功：CG小鼠未见蓝色胶原沉积；MG小鼠可见蓝色胶原沉积明显；并随着小鼠生存时间延长，蓝色胶原沉积加重，EG小鼠可见蓝色胶原沉积介于CG组与MG组之间；LG组蓝色胶原沉积较EG更重（图1-3）。

2.4 4组小鼠肺组织HYP含量的比较 见表1。

由表1可见，与CG组比较，其他各组各时点HYP含量均发生显著变化，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与MG组比较，EG组第7、14、28天HYP含量均显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与EG组比较，LG组第7、14、28天HYP含量均显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

图1 各组第7天肺组织情况（A：CG组，B：MG组，C：EG组，D：LG组；Masson染色，×400，下同）

图2 各组第14天肺组织情况（A：CG组，B：MG组，C：EG组，D：LG组）

图3 各组第28天肺组织情况（A：CG组，B：MG组，C：EG组，D：LG组）

表1 4组小鼠肺组织HYP含量的比较（μg/mg）

表2 4组小鼠VEGF的IOD值比较（×103）

2.5 4组小鼠VEGF的IOD值比较 见表2。

由表2可见，与CG组比较，其他各组各时点VEGF的IOD值均发生显著变化，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与MG组比较，EG组第7、14、28天VEGF的IOD值均发生显著变化，差异均有统计学意义（均P＜ 0.01）；与EG组比较，LG组第7、14、28天VEGF的IOD值均显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

3 讨论

HDAC抑制剂可以通过抑制组蛋白去乙酰化酶，从而阻断由于募集功能紊乱而导致的基因表达受抑进而达到抗肿瘤效应[10]。在小鼠模型中，Hop（HDAC相关的核蛋白）过表达会导致心肌纤维化，而HDACI则可以逆转这一过程[11]。HDAC抑制剂TSA通过分子靶向作用减少组蛋白的乙酰化程度，从而改变组蛋白乙酰化的失衡状态所引起的基因调控失衡达到调控基因表达[12]，诱导肿瘤细胞的生长阻滞、分化和凋亡。有研究显示，TSA可以抑制多种肿瘤细胞的生长，诱导细胞凋亡[13-14]。

TSA主要用于抑制肿瘤新生血管形成，未见有关肺纤维化的报道。从临床过程和病理学改变看，博莱霉素所致肺纤维化（月PF）与特发性肺间质纤维化非常相似[7-8]。在月PF过程中，肺组织HYP含量进行性增加。HYP的生成对维持胶原的稳定及前胶原的分泌具有重要作用，未羟化的前胶原链在细胞内被降解；如果过度羟化，HYP含量过多，使胶原稳定性增加、分解减少，可导致组织纤维化[15]。早期给予TSA处理后羟脯氨酸含量显著降低，说明早期给予TSA处理减少了胶原中脯氨酸羟化，促进了胶原降解，抑制了肺纤维化发生。

新生血管形成在肺纤维化过程中发挥着重要作用[2]。研究证实，TSA可以抑制低氧或VEGF诱导的新生血管形成[5-6]。在肺损伤后气道上皮等释放过多VEGF，促进黏附和肺组织的新生血管形成。大量新生血管为成纤维细胞提供营养，新生血管形成可促纤维化形成，反过来抑制新生血管形成可以减缓肺纤维化进程。通过检测VEGF的表达可以判断肺纤维化的程度。本实验结果表明，EG组VEGF表达较MG组减少，较CG组增多，说明肺纤维化程度与VEGF的表达呈正相关。免疫组化检测发现，月LM损伤肺早期可见肺间质内先是巨噬细胞随后弥漫性间质强烈表达VEGF并伴有肺间质大量新生血管形成[16]。新生血管形成可以促进肺纤维化形成，反过来抑制新生血管形成可以减缓肺纤维化进程。TSA通过阻断VEGF对内皮细胞的营养、增殖和促进存活作用，促进内皮细胞凋亡，抑制新生血管形成。

综上所述，早期给予TSA阻断VEGF/VEGFR信号途径，抑制巨噬细胞等炎症细胞黏附、活化和降低血管通透性等途径，抑制新生血管形成减轻肺损伤和月PF。后期主要是纤维增生阶段，无明显的炎症反应和炎性细胞浸润，VEGF表达水平也不高，TSA治疗效果不明显。今后还可在TSA对月PF新生血管形成的CD31抑制方面进一步研究。

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Effect of trichostatin A on lung angiogenesis in mice with bleomycin-induced pulmonary fibrosis

Objective To investigate the effects of histone deacetylase inhibitor(HDACI）trichostatin A(TSA)on lung angiogenesis in mice with bleomycin-induced pulmonary fibrosis．MethodsOne hundred and twenty C57BL/6 mice were randomly divided into four groups(n=30 in each group)．Pulmonary fibrosis was induced by intratracheal injection of bleomycin 10mg in MG,EG and LG groups．Intraparitoneal injection of TSA was given 2/w to mice in EG(d1-d14)and LG(d15-28)groups;and same volume of dimethyl sulfoxide(DMSO)was given to mice in CG and MG groups．Mice were sacrificed in batches at d7,14 and 28,the lung tissue specimens were stained with HE and Masson method and the fibrosis was evaluated with Szapiel score．The hydroxyproline(HYP)level was measured and VEGF was detected by immunohistochemistry．ResultsThe HYP contents and the expression of VEGF in MG and LG were significant higher than those in CG;while the HYP level and the VEGF expression in EG were lower than those in MG and LG．ConclusionResults indicate that early administration of TSA in mice with bleomycin induction can attenuate the pulmonary fibrosis via inhibiting angiogenesis，however,delayed administration of TSA has no significant effect．

Histone deacetylase inhibitor(HDACI) Pulmonary interstitial fibrosis Angiogenesis

2013-05-13）

（本文编辑：欧阳卿）

杭州市卫生科技计划A类项目（2011A017）

310015 杭州师范大学附属医院呼吸科

施长春，E-mail：shicc1961@163.com