脂氧素A4受体ALXR在子宫内膜异位症患者在位及异位子宫内膜组织中的表达及意义

王建芳 范伟荣 刘杰 伊碧霞 章根琴

脂氧素A4受体ALXR在子宫内膜异位症患者在位及异位子宫内膜组织中的表达及意义

王建芳 范伟荣 刘杰 伊碧霞 章根琴

目的 探讨脂氧素A4受体ALXR在子宫内膜异位症（EMs）患者在位及异位内膜组织中的表达水平及其临床意义。方法因EMs行腹腔镜手术治疗的患者27例，留取在位子宫内膜组织（EMs在位内膜组）和异位子宫内膜组织（EMs异位内膜组），取同期因良性卵巢囊肿行腹腔镜手术治疗患者30例为对照组，留取宫腔内正常内膜组织。分别采用实时荧光定量PCR技术、免疫组化法检测各组内膜组织中ALXR mRNA及蛋白表达水平。结果EMs异位内膜组ALXR mRNA表达水平为0.069±0.020，EMs在位内膜组为0.039±0.013，对照组为0.019±0.008,EMs异位和在位内膜组的表达水平均明显高于对照组（均P＜0.05），EMs异位内膜组又高于在位内膜组（P＜0.05）。EMs异位和在位内膜组ALXR蛋白表达水平明显高于对照组（P＜0.05）。结论ALXR mRNA及蛋白在EMs异位及在位内膜组织中均呈高表达状态，推测ALXR可能与EMs发病有关。

子宫内膜异位症 脂氧素A4 脂氧素A4受体ALXR 炎症

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）即具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆黏膜以外的身体其它部位，是育龄妇女的常见病、难治病，其主要以不孕、慢性疼痛及粘连形成为特征，严重影响着患者的健康和生活质量。目前其发病机制仍尚不清楚，但作为一种炎症性相关疾病的观点已得到广泛支持。脂氧素A4（lipoxins A4，LXA4）作为炎症反应的内在“刹车信号”，通过与其受体ALXR结合而发挥广泛强效的促炎症消退效应。最近研究发现LXA4与EMs有关[1]。本研究检测了EMs患者在位、异位子宫内膜以及正常子宫内膜中ALXR mRNA及蛋白表达水平，探讨ALXR在EMs的表达水平及其意义，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2012-02—09本科行腹腔镜手术治疗的患者为研究对象。入选标准：（1）患者年龄20～40岁；

（2）具有相对规则的月经周期；（3）术前3个月未使用过内分泌药物，6个月内无妊娠及哺乳史、刮宫手术史；（4）既往无EMs病史；（5）术前无围绝经期症状者；（6）组织学诊断排除恶性肿瘤。根据内膜组织的来源分为3组：（1）EMs异位内膜组（27例）：手术病理证实为EMs，术中取典型异位内膜组织（腹腔、盆壁及卵巢异位灶）。（2）EMs在位内膜组（27例）：以上患者同时负压刮取宫腔内膜组织。（3）对照组（30例）：因良性卵巢囊肿行手术治疗的患者，不合并EMs或子宫腺肌症，负压刮宫方法留取宫腔内膜组织，术后病理证实为正常子宫内膜。患者年龄20～40（29.4±0.2）岁；对照组年龄20～40（30.3± 0.4）岁≥两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经本院伦理委员会批准，并取得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR技术检测内膜组织中ALXR mRNA的表达水平 用TRIzol法提取总RNA，逆转录合成cDNA。按照Genbank中人ALXR、磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehydephosphate dehdrogenase，GAPDH）(内参照)基因序列，利用Primer5.0软件设计引物，引物由杭州赫贝科技有限公司合成。ALXR引物正义链：5＇-GCCATCTGCTATGGGCTCAT-3＇，反义链5＇-CGTAAGGGACGGCTGGATTT-3＇，扩增片段为91 bp。内参照为GAPDH，正义链为5＇-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3＇， 反 义 链 为 5＇-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3＇，扩增片段为258 bp。采用全自动荧光定量PCR仪（CFX connect Real-Time PCR System）进行反应。20μl反应体系中实时荧光定量PCR反应预混液（2×）10.0μl，上下游引物各0.4μl，cDNA 2.0μl（终浓度为0.2μmol/L）。95.0°C预变性3min，95.0°C变性10s，61.0°C退火/延伸20s，共40个循环。熔解曲线条件为：从70～95°C，每10s上升0.5°C。扩增产物进行熔解曲线分析和测序以确定产物的特异性，产物测序由杭州赫贝科技有限公司完成。PCR分析软件BIO-RAD CFX Manager进行自动分析并计算结果。循环阈值（threshold cycle，Ct）与mRNA PCR初始表达量呈负相关。△Ct值代表目的基因相对于内参照基因的表达量。先将不同组别的△Ct值样本均数用SPSS13.0统计软件进行分析，若差异有统计学意义（P＜0.05），再用2-ΔΔCt公式进行相对定量。

1.2.2 免疫组化SP法检测内膜组织中ALXR蛋白定位表达 标本用10%甲醛溶液固定，脱水，常规石蜡包埋。蜡块切片（4μm）后，脱蜡至水。滴加体积分数3% H2O2溶液，室温下孵育10min。用微波进行抗原热修复。滴加1∶100稀释的一抗（美国novus公司）,37°C孵育2h，磷酸盐缓冲液（PBS）洗2min×3次。二氨基联苯胺（DAB）染色，苏木素复染，脱水、透明、封片后在显微镜下观察，背景为紫蓝色，阳性表达在胞质，呈棕褐色。高倍视野下随机拍5个视野（×200），并用病理图像分析软件（IPP）进行蛋白半定量分析，计算平均光密度值。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件,测得计量资料均以表示，进行方差齐性及正态性检验，两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 ALXR mRNA在在位子宫内膜、异位子宫内膜和正常子宫内膜的表达。

2.1.1 实时荧光定量RT-PCR法检测ALXR mRNA通过熔解曲线验证扩增产物 结果显示为单峰,表明产物具有特异性，见图1-2。

图1GAPDH熔解曲线

图2 ALXR熔解曲线

2.1.2 各内膜组织中ALXRmRNA的表达水平比较 ALXRmRNA在异位子宫内膜的表达水平为0.069±0.020，在位子宫内膜组中的表达水平为0.039±0.013，明显高于对照组的0.019±0.008，差异有统计学意义（t=12.328、6.943，均P＜0.05），并且异位子宫内膜中ALXR mRNA的表达水平高于在位子宫内膜中的表达水平，差异也有统计学意义（t=-6.303，P＜0.05）。

2.2 各组内膜组织中ALXR蛋白定位及半定量表达水平比较 AXLR蛋白在子宫内膜的间质细胞及腺细胞中均有表达，其定位于细胞质，呈棕黄色。AXLR蛋白在各组间的表达及定位见图3。AXLR在异位子宫内膜和在位子宫内膜中相对表达量为分别为0.045±0.011、0.023±0.013，均高于对照组的0.008±0.003，差异均有统计学意义（t=9.079、6.528，均P＜0.05）。

图3 ALXR蛋白在不同子宫内膜的表达（A：EMs异位子宫内膜细胞中有大量ALXR蛋白表达，SP法，×400；B：EMs在位子宫内膜细胞中有中量ALXR蛋白表达，SP法，×400；C：对照组内膜细胞中无明显AXLR蛋白表达，SP法，×400）

3 讨论

目前，ALXR在EMs中的研究非常有限，Motohashi等[1]曾报道过ALXR在EMs患者异位内膜组织中的mRNA水平高于正常人子宫内膜组织。本研究结果与Motohashi等的研究结论一致。本研究发现EMs患者异位子宫内膜组织中ALXR mRNA和蛋白水平显著高于正常子宫内膜组织，并且EMs患者异位子宫内膜组织中ALXR mRNA和蛋白水平高于EMs患者在位子宫内膜。

LXA4作为一类新型的内源性脂质抗炎消退介质，通过与其受体ALXR发挥抗炎、促炎症消退的双重作用，被认为是内源性的炎症“刹车信号”，可以协调急性炎症到慢性炎症的转化，以达到控制炎症，削弱慢性炎症的趋势。1992年，Fiore等在人中性白细胞中首次发现一种与LXA4高亲和性的特异G-白偶联受体；随后这种G-蛋白偶联受体被鉴定为ALXR（FPRL-1）。人类的ALXR属于G-蛋白偶联受体家族，包括FPRI、FPRL-1/ ALXR和FPR3三个成员，在中性白细胞、单核细胞、活化的T细胞等免疫细胞以及在肠上皮细胞、滑膜成纤维细胞、支气管上皮细胞、肾小球系膜细胞等固有细胞中均有表达[2]。研究发现LXA4可通过其受体ALXR作用于多种类型的细胞，在抗炎促炎症消退、减轻组织侵袭、抑制血管生成以及抗增殖、抗纤维化效应等方面发挥重要作用[3-5]。另研究发现多种细胞因子可以上调ALXR的转录活性，提示ALXR的表达受炎性环境的调节[6]。

目前EMs发病机制尚不明确，但EMs作为一种炎症性相关疾病的观点已得到广泛支持。一般认为EMs是起始于子宫内膜组织在腹腔内膜的种植，而炎性环境对于这种疾病的发展可能起着重要作用。EMs常伴随着多种炎症反应，患者腹腔内免疫炎症环境的改变，促进了异位灶的生存和增长。越来越多的证据表明EMs中子内膜组织的种植具有类似于炎症的特征。与健康的妇女相比，EMs患者腹腔内的数目和活性增加，而其分泌的一些与炎症有关的因子如IL-1β，IL-6，IL-8，TNF-a，MCP-1，MMP-9等也有明显的上升[7-9]。这些细胞因子通过自分泌或旁分泌发挥细胞间的通讯作用，并对巨噬细胞、单核细胞、白细胞等免疫细胞产生趋化作用，和炎性细胞之间产生正反馈效应[10]，进一步增加组织侵袭、血管形成能力乃至局部性激素浓度，促进子宫内膜的异位存活，加重炎症，引发疼痛和不孕[11]。

LXA4在EMs中的研究，目前尚处在一个起步阶段，国内外相关的研究还非常有限，但是这无法掩盖LXA4在EMs中的研究和应用前景。Motohashi等[1]首先研究了LXA4受体ALXR在雌性大鼠子宫内膜、子宫肌膜和卵巢中的表达情况，结果显示ALXR在子宫内膜和子宫肌膜中的基因表达显著高于在卵巢中的表达，在动情前期（proestrus）ALXR的基因表达显著增加，而在动情期（estrus）阶段开始减少。该研究还发现孕酮可使ALXR表达明显减少，雌激素使其微量减少，而促性腺激素对其表达几乎没有影响。而在子宫内膜异位症的大鼠模型中，ALXR的表达显著高于正常对照组。Chen等[12-13]研究发现外源性脂氧素（15-epi-LXA4）可显著抑制子宫内膜异位症小鼠异位病灶的重量和大小，且不影响小鼠的性周期，也无明显不良反应。研究发现15-epi-LXA4显著降低内异症小鼠腹腔免疫细胞中IL-1β、TNF-a的基因和蛋白表达；同时，15-epi-LXA4还可显著降低MMP-2和MMP-9的表达和酶活性。本研究发现EMs患者异位子宫内膜组织中ALXR mRNA和蛋白水平显著高于正常子宫内膜组织，并且EMs患者异位子宫内膜组织中ALXR mRNA和蛋白水平亦高于EMs患者在位子宫内膜，推测EMs患者体内子宫内膜细胞异常增殖和组织侵袭可能诱导ALXR的表达，而LXA4与ALXR介导的促炎症消退效应能否抑制EMs的发生、发展尚有待进一步的研究。

目前，国内关于LXA4与EMs的研究尚处于起步阶段，进一步的研究将有助于揭示EMs的炎症性发病机制，并可为EMs的抗炎药物的研制提供理论基础。

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Expression of lipoxin A4 receptor ALXR in eutopic and ectopic endometrium of patients with endometriosis

Objective To investigate the expression of lipoxin A4 receptor(ALXR)in eutopic and ectopic endometrium of patients with endometriosis.MethodsTwenty seven patients with endometriosis underwent laparoscopic surgery in our hospital between February 2012 and September 2012,the tissue samples of eutopic and ectopic endometrium were collected; and uterine endometrium samples were also collected from 30 patients with benign ovary cysts as controls.The mRNA and protein expression of ALXR in the eutopic endometrium,ectopic endometrium of endometriosis patients and control endometrium were detected by real-time fluorescent quantitative RT-PCR and immunohistochemistry,respectively.ResultsThe mRNA expression of ALXR was 0.069±0.013 in ectopic endometrium and 0.039±0.013 in eutopic endometrium of endometriosis, which were significantly higher than that of the control(0.019±0.008,P＜0.05).The mRNA expression of ALXR in the ectopic endometrium was also higher than that of eutopic endometrium of endometriosis(P＜0.05).Compared with the control,the expression of ALXR protein in eutopic and ectopic endometrium of endometriosis were increased(P＜0.05).ConclusionThe ectopic and eutopic endometrium in patients with endometriosis shows high expression of lipoxin A4 receptor mRNA and protein, which indicates that ALXR may be associated with the pathogenesis of endometriosis.

Endometriosis Lipoxin A4 Lipoxin A4 receptor ALXR Inflammation

2014-04-08）

（本文编辑：沈昱平）

金华市科技局资助项目（2011-3-042）

321000 金华市人民医院妇产科

王建芳，E-mail：jefayeking@163.com