与肾小管上皮转分化相关的miRNA的初步筛选

邵驾宇 章慧娣 潘嘉林 尤小寒 薛向阳 黄朝兴

●论 著

与肾小管上皮转分化相关的miRNA的初步筛选

邵驾宇 章慧娣 潘嘉林 尤小寒 薛向阳 黄朝兴

目的 观察miRNA在大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）发生上皮-肌成纤维细胞转分化（EMT）过程中的变化，筛选与肾小管上皮细胞转分化相关的miRNA。方法体外培养NRK-52E，用5 ng/ml转化生长因子-β1（TGF-β1）分别作用0、3、6、12、24、48 h，以0 h为空白组（BC组），余为TGF-β1组。倒置相差显微镜观察细胞形态学变化；real-time PCR法检测细胞内α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E钙蛋白（E-cad）、1型胶原（ColⅠ）和纤连蛋白（FN）的mRNA表达水平；Western blot法检测细胞内α-SMA的表达水平；ELISA法检测上清液中FN的含量；茎环实时荧光定量PCR法检测6条miRNA在细胞内的表达水平。结果与BC组比较，TGF-β1组部分细胞失去原有的鹅卵石形态，转变成成纤维细胞特有的梭形；细胞内α-SMA、ColⅠ和FN的mRNA表达上调，E-cad的mRNA表达下调，细胞内α-SMA表达量增多，细胞上清液中FN含量升高（均P＜0.05）；miR-30d、miR-132和miR-21的表达上调，miR-200b、miR-192和miR-10b的表达下调（均P＜0.05）。结论TGF-β1可诱导NRK-52E发生EMT。miR-30d、miR-132、miR-21、miR-200b、miR-192和miR-10b可能参与大鼠肾小管上皮细胞EMT，值得进一步研究。

大鼠肾小管上皮细胞 肾小管上皮转分化 转化生长因子-β1 microRNA

肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）的基本病理特征是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在肾间质大量堆积。肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化（epithelial-myofibroblast transdifferentiation，EMT）是造成ECM堆积的主要原因之一。目前已有一些动物实验显示部分miRNA参与肾小管上皮细胞EMT。我们在前期的动物体内实验基础上，以体外培养的大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）为研究对象，在转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）作用下，观察miR-132、miR-21、miR-10b、miR-200b、miR-192和miR-30d这6条miRNA在NRK-52E发生EMT过程中的改变，以期认识这些miRNA是否参与调控肾小管上皮细胞分泌ECM的过程。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂 NRK-52E（购自中科院上海细胞库），DMEM高糖培养液、0.25%胰蛋白酶-EDTA和胎牛血清（均购自美国GIBCO公司），人类重组TGF-β1（购自美国R&D公司），Trizol提取液（购自美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒（购自加拿大MBI Fermentas公司），SYBR GreenⅠMix（购自美国Roche公司），Real time PCR引物（购自上海Invitrogen公司），α-SMA抗体及GAPDH抗体（购自美国Abcam公司），大鼠纤连蛋白ELISA试剂盒（购自上海西塘生物科技公司）。

1.2 NRK-52E的培养 用含8%胎牛血清的DMEM高糖培养液在37℃，5%CO2的孵育箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化，隔天换液，2～3 d传代。

1.3 TGF-β1诱导转分化 细胞接种于培养皿后，生长至50%～60%融合状态时,换成无血清DMEM高糖培养液同步化处理16h，用含5ng/ml TGF-β1的DMEM高糖培养液分别培养0、3、6、12、24、48h，将TGF-β1作用0h的细胞设为空白对照组（BC组），将TGF-β1作用3、6、12、24、48h的细胞设为TGF-β1组。

1.4 real-time PCR检测α-SMA、E-cad、Col I、FN的miRNA表达水平 分别于TGF-β1作用细胞0、3、6、12、24h时在培养皿中加入1 ml Trizol裂解细胞，氯仿萃取，异丙醇浓缩过夜，得总RNA，分光光度计测RNA纯度，甲醛变性凝胶电泳质检RNA质量。取1μg总RNA，按照Fermentas Reverse Transcription Kit逆转录成cDNA，再用Roche LightCycler 480实时荧光定量PCR仪进行扩增，反应条件：95℃5min预变性，95℃10s变性，58℃10s退火，72℃10s延伸，45个循环。技术重复3次，生物学重复6次。以GAPDH为内参进行归一化。样品目的基因的相对表达率采用△△Ct方法计算，目的基因的相对量=

1.5 Western blot法检测细胞内α-SMA表达水平 分别于TGF-β1作用细胞0、12、24、48h时裂解细胞提取蛋白，BCA法测蛋白浓度，各组上样30μg行10%SDSPAGE电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2h，一抗（α-SMA抗体1∶500）4℃孵育过夜，TBS-T溶液洗膜3次，每次10min。室温下加入IgG抗体（1∶4 000）孵育1.5h，洗膜3次，用Odyseyy近红外双色激光成像系统选择800通道进行扫描条带，以GAPDH为内参标化α-SMA表达，生物学重复6次，技术重复3次，用AlphaEaseFC凝胶成像分析软件进行半定量分析。

1.6 ELISA法检测上清液中FN的含量 分别于TGF-β1作用细胞0、12、24、48h时收集细胞上清液，4℃，4 000g×5min离心，吸取上清液，用大鼠FN ELISA试剂盒检测各浓度点的蛋白分泌量。生物学重复6次，技术重复3次。

1.7 茎环Real-time PCR检测miRNA的表达水平 取1μg总RNA，按照Fermentas Reverse Transcription Kit加入逆转录茎环引物逆转录成cDNA，再用Roche LightCycler 480实时荧光定量PCR仪进行扩增，反应条件：95℃5min预变性，95℃10s变性，58℃10s退火，72℃10s延伸，45个循环，技术重复3次，生物学重复6次。以U6 RNA为内参进行归一化。样品目的基因的相对表达率采用△△Ct方法计算，方法同上。

1.8 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件，计量数据以表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 NRK-52E形态学改变 TGF-β1作用0、3、6、12h，细胞呈肾小管上皮细胞原有的卵圆形“铺路石”形状；TGF-β1作用24h，部分细胞拉长呈梭形改变；TGF-β1作用48h，更多细胞呈梭形改变，部分细胞凋亡，见图1。

2.2 α-SMA、E-cad、Col I和FN的mRNA表达水平的变化 与BC组比较，TGF-β1组各时点细胞内肌成纤维细胞标志物α-SMA的mRNA表达上调而上皮细胞标志物E-cad的mRNA表达均下调（均P＜0.05）；细胞内Col I和FN的mRNA的表达均上调（均P＜0.05），且呈时间依赖性，见表1。

表1 TGF-β1作用不同时间NRK-52E细胞内α-SMA、E-cad、Col I和FN的mRNA的表达水平变化

2.3 细胞内α-SMA表达水平的变化 与BC组比较，TGF-β1组各时点细胞内α-SMA的表达量均明显升高（均P＜0.05），在TGF-β1作用24 h时达峰值2.24±0.55，见图2。

图1 TGF-β1作用不同时间NRK-52E的形态改变

图2 TGF-β1作用不同时间NRK-52E内α-SMA的表达水平变化

2.4 上清液FN含量的变化 上清液FN含量0h为1.0±0，12、24、48h分别为1.11±0.03、1.32±0.20、1.55±0.15。与BC组比较，TGF-β1组上清液FN的含量均明显升高（均P＜0.05），且呈时间依赖性。

2.5 miRNA的表达水平变化 与BC组比较，TGF-β1组6条miRNA的表达均存在差异。TGF-β1作用3、6、12、24h后，miR-30d、miR-132和miR-21的表达上调，其中miR-30d和miR-132表达上调呈时间依赖性（P＜0.05）；miR-200b、miR-192和miR-10b的表达均下调，其中miR-192在TGF-β1作用12h达最低值（P＜0.05），见表2。

3 讨论

我们在前期工作中通过大鼠单侧输尿管梗阻（UUO）及5/6肾切除两种RIF模型，采用real-time PCR法筛选了与RIF相关的部分miRNA，其中比较一致的6条miRNA（miR-30d、miR-132、miR-21、miR-200b、miR-192和miR-10b）被选为本研究筛选对象[1]。

表2 TGF-β1作用不同时间miRNA在NRK-52E细胞内表达水平的比较

本研究中TGF-β1组部分细胞肥大，拉长，失去原有的鹅卵石形态，向成纤维细胞特有的梭形发展，细胞内上皮细胞黏附分子E-cad的mRNA表达明显下降，肌成纤维细胞标志物α-SMA的mRNA表达明显上调，以及纤维化指标ColⅠ和FN的mRNA表达均上调且呈时间依赖性，细胞内α-SMA表达水平升高和上清液中FN含量升高，以上各点提示本实验造模成功，证实TGF-β1可诱导体外培养的NRK-52E发生转分化，促进合成和分泌ECM。

本研究TGF-β1组有3条miRNA（miR-30d、miR-132、miR-21）表达上调，3条miRNA（miR-200b，miR-192、miR-10b）表达下调，其中miR-30d和miR-132的表达变化，与ColⅠ和FN的mRNA的表达一样，都具有TGF-β1作用的时间依赖性。提示这些miRNA参与TGF-β1诱导体外培养的NRK-52E转分化发生过程，促进ECM的合成和分泌。

miR-132表达受cAMP反应元件结合蛋白（CREB）调控[2]。Kriegel等[3]研究发现人肾小管上皮细胞经TGF-β1刺激后miR-132表达上调；Stachurska等[4]研究显示在赭曲霉素A作用下，猪肾近曲小管细胞（LLC-PK1）内TGF-β1和TGF-β2的miRNA和miR-132表达均上调，而抑制miR-132表达可抑制TGF-β2 miRNA表达，均提示miR-132促纤维化。我们前期的研究结果显示，在大鼠UUO和5/6肾切除模型肾组织中miR-132均呈高表达[1]，用TGF-β1作用大鼠肾间质成纤维细胞（NRK-49F）后，miR-132及ColⅠmRNA表达上调，转染miR-132类似物至NRK-49F可上调ColⅠmRNA的表达，提示miR-132促进RIF[5]。本研究中TGF-β1组miR-132呈高表达，且与ColⅠ和FN的mRNA表达上调一样，具有TGF-β1作用的时间依赖性，推测miR-132通过作用EMT相关的靶基因参与EMT的调控，其中miR-132与ColⅠ和FN的相关性值得进一步研究。

关于miR-30d的研究则集中于肿瘤领域[6-9]。EMT作为肿瘤细胞发生和转移的重要分子机制，在肿瘤细胞的形态改变、迁移、侵袭等生物学行为中起关键作用。Yao等[8]研究发现miR-30d通过靶向抑制肿瘤抑制基因GNAI2促进肝癌细胞的迁移和侵袭。另有研究发现发生淋巴转移的声门上型喉鳞癌患者肿瘤组织中miR-30d表达高于无淋巴转移的同类患者[9]。上述发现均提示miR-30d可能在肿瘤转分化中起正向调节作用。本研究中miR-30d在TGF-β1组呈高表达且与ColⅠ和FN的miRNA表达一样具有TGF-β1作用的时间依赖性，亦提示miR-30d正向调节上皮细胞转分化。通过Targetscan、miRbase和pictar预测miR-30d相关靶基因，提示胶原蛋白可能为其候选靶基因，miR-30d与ColⅠ的关系有待进一步探索。

Xiong等[10]用TGF-β1诱导NRK-52E转分化的研究显示TGF-β1通过Smad信号传导通路上调miR-21的表达；将miR-21类似物转染至NRK-52E可诱导转分化，而用miR-21抑制物能够阻断TGF-β1诱导的转分化。而miR-200家族（包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429）在TGF-β1作用下表达均下调。转染miR-200类似物至NRK-52E能抑制TGF-β1诱导的转分化；相反，用miR-200抑制剂降低miR-200的表达能诱导NRK-52E转分化。本研究中TGF-β1组miR-21呈高表达，而miR-200b呈低表达，与Xiong等的研究结果一致，提示miR-21促进EMT，而miR-200b抑制EMT。

miR-192是肾脏特异表达的miRNA，其与EMT的关系尚存争议。既往研究显示，miR-192通过作用ZEB1和Smad-作用蛋白1（SIP1，又称ZEB2）的miRNA调控胶原的产生，促进TGF-β1诱导的EMT[11]；而近年有研究发现，TGF-β1使人肾小管上皮细胞miR-192表达下调，而过表达miR-192可拮抗TGF-β1的促转分化作用[12]。我们在大鼠UUO模型组发现miR-192呈低表达且与肾小管间质病变负相关[1]，且本研究中miR-192在TGF-β1作用下表达下调，均支持miR-192抑制转分化的观点。关于miR-10b的研究主要涉及肿瘤领域[13-16]，其与纤维化的关系未见报道。既往研究显示miR-10b促进乳腺癌细胞转分化[13-14]，提示miR-10b参与肿瘤细胞转分化且起正向调节作用。但在我们前期大鼠UUO体内模型中，肾组织miR-10b在术后3 d表达下调[1]，且在本研究体外模型中TGF-β1作用下miR-10b表达下调，均提示miR-10b抑制肾小管上皮转分化，与其在肿瘤细胞转分化中的作用相反，可能为miR-10b在不同类型的EMT中作用机制不同，其与EMT的关系有待进一步研究与明确。

综上所述，在TGF-β1诱导的NRK-52E转分化的模型中，大鼠肾小管上皮细胞内miR-30d、miR-132、miR-21、miR-200b、miR-192和miR-10b存在较为明显的差异表达，而且伴随纤连蛋白在细胞内外表达量增加，提示以上microRNA参与大鼠EMT的发生、发展过程，影响大鼠肾小管上皮细胞合成和分泌ECM，其具体的作用机制有待进一步探讨。

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Screening of microRNA related to epithelial-myofibroblast transdifferentiation of renal tubular cells

Objective To screen microRNA(miRNA)related to epithelial-myofibroblast transdifferentiation(EMT)of renal tubular epithelial cells.MethodsNormal rat kidney tubular epithelial NRK-52E cells were cultured and stimulated with 5 ng/ml TGF-β1 for 0,3,6,12,24 and 48h.Morphological changes of NRK-52E cells were observed with inverted phase contrast microscope at different time points after stimulation.The expression of α-smooth muscle actin(α-SMA)mRNA,E-cadherin (E-cad)mRNA,collagen I(Col I)mRNA and fibronectin(FN)mRNA was detected with real time qPCR.Western blot was performed to analyze the expression of α-SMA and ELISA was used to quantitatively detect the FN in the supernatant．Six selected miRNAs were examined by stem-loop real-time qPCR.ResultsSome NRK-52E cells underwent morphological changes after stimulation of TGF-β1,changed from typical cobblestone shape to spindle-like in appearance.Compared with BC group,the expression of α-SMA mRNA,Col I mRNA and FN mRNA was enhanced after stimulation of TGF-β1(P＜0.05),while the expression of E-cadherin mRNA was decreased(P＜0.05).The α-SMA content in cells and FN content in supernatant was significantly increased(P＜0.05)after the stimulation of TGF-β1.Compared with BC group,miR-30d,miR-132 and miR-21 were up-regulated(P＜0.05),while miR-200b,miR-192 and miR-10b were down-regulated(P＜0.05).ConclusionEMT of NRK-52E cells can be induced by TGF-β1 stimulation.miR-30d,miR-132,miR-21,miR-200b,miR-192 and miR-10b may be related to EMT in renal tubular cells.

NRK-52E Epithelial-myofibroblast transdifferentiation Transforming growth factor-β1 miRNA

2014-01-06）

（本文编辑：沈叔洪）

温州市科技计划项目（Y20080116）；浙江省自然科学基金资助项目（Y12H050017）；浙江省医药卫生科技计划项目（NO.2010KYA135）

325000 温州医科大学附属第一医院肾内科（邵驾宇、章慧娣、尤小寒、黄朝兴）；温州医科大学附属第二医院心血管内科（潘嘉林）；温州医科大学微生物免疫学教研室（薛向阳）

黄朝兴，E-mail：huangzhaoxing@medmail.com.cn