细梗香草总皂苷诱导肺癌细胞H460凋亡及其机制的研究

费正华 陈云亮 马胜林

细梗香草总皂苷诱导肺癌细胞H460凋亡及其机制的研究

费正华 陈云亮 马胜林

目的 观察细梗香草总皂苷（LC）对非小细胞肺癌H460细胞增殖和凋亡的影响。方法 在H460肺癌细胞培养时加入不同浓度的LC，采用MTT法和克隆形成实验检测细胞的增殖活性，AnnexinⅤ/PI（FCM）法观察LC对肺癌细胞凋亡的诱导作用和周期分布的影响。DCFH-DA荧光探针FCM检测细胞内活性氧生成，Western blot法检测NF-κB、I-κB、Bax、Bcl-2、Capase-3的蛋白表达。 结果 LC可抑制H460细胞生长，具有剂量、时间依赖性；LC作用H460细胞后克隆形成率明显下降。LC可引起H460细胞凋亡，并可将H460生长阻滞在S期。LC以浓度依赖方式增高H460细胞内活性氧水平，还可使H460细胞I-κB、Bax和Capase-3表达增加，而使NF-κB和Bcl-2表达降低。结论 LC可以抑制H460细胞增殖，可能是通过增加细胞内活性氧表达，激活了肺癌细胞线粒体凋亡途径。

细梗香草 肺癌 凋亡 活性氧

非小细胞肺癌恶性程度高，在肿瘤相关死亡原因中排首位[1]。许多患者初诊时即为晚期，因此失去手术机会。以铂类为基础的第三代化疗药物在非选择性的晚期非小细胞肺癌中总体有效率为30%～40%，带来的生存获益有限，且存在一定的毒副反应[2]。寻找新的高效低毒的药物是肺癌治疗重要的研究方向。祖国传统中草药在肿瘤治疗中具有增效减毒的独特优势，但对具体的药效机制等基础研究相对缺乏[3-4]。本文旨在研究细梗香草（Lysimachia capilliposide hemsl）提取物总皂苷（Capilliposide，LC）对非小细胞肺癌H460细胞的作用及其作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药物及细胞株 人肺癌细胞株H460由上海生物细胞库提供。LC由浙江大学生物医学工程学系实验室提供。

1.1.2 主要试剂 RPMI-1640培养基、胰蛋白酶由美国GI月CO公司提供；新生小牛血清（FCS）由杭州四季青生物科技有限公司提供；MTT由美国Sigma公司提供；活性氧（ROS）检测试剂盒和月CA定量试剂盒由南通碧云天生物科技有限公司提供；细胞凋亡和周期检测试剂盒由杭州联科生物公司提供，抗体NF-κ月、I-κ月，Capase-3由美国Santa Cruz公司提供，月ax、月cl-2及相应二抗由美国CST公司提供。

1.2 方法

1.2.1 生长抑制率检测 将H460细胞以2.0×105/孔接种于96孔培养板中，37℃过夜。将细胞分观察组和对照组。观察组分别加入0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μg/ ml的LC。继续培养24、48、72h。采取MTT法检测，加入1mg/ml的MTT溶液100μl/孔，继续培养4h，然后弃上清液，加入150μl/孔酸化异丙醇，振荡10min后用酶标仪检测每孔D490值，计算H460细胞存活率。细胞存活率=观察组D490/对照组D490×100%。实验重复3次，取平均值。

1.2.2 克隆形成实验 取对数生长期H460细胞，消化接种于培养皿，每皿加入9ml含500个H460细胞的培养液。分3组加入0、2、4μg/ml LC，每组重复3次。培养箱培养14d，弃培养液后P月S洗涤细胞2次，4%多聚甲醛固定10min，P月S洗涤细胞3次，用结晶紫染色液染色10min，双蒸水洗涤后，将计数＞50个细胞克隆并拍照。1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡率 取对数生长期的H460细胞,调整细胞的初浓度至（2.0×105）个/ ml加入6孔板,分3组加入0、2、4μg/ml LC。置37℃5% CO2培养箱培养24h,收集细胞,以70%乙醇固定24h后P月S液洗涤2次,离心（离心半径30cm，500r/min，离心5min）后弃上清液。分别加入5μl AnnexinV-FITC和10μl碘化丙啶（PI），混匀。在室温下，避光反应5～15min检测细胞凋亡率。加入70%冷乙醇固定细胞，再加入10μl PI,混匀，检测细胞周期分布，以上实验重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测细胞内ROS水平 取对数生长期的H460细胞,调整细胞的初浓度至（2.0×105）个/ ml加入6孔板,分3组加入0、2、4μg/ml LC。置37℃5%CO2培养箱培养3h,收集细胞。加入 10μmol/L DCFH-DA孵育2～3 h，然后用无血清的1640培养基洗涤3次，流式细胞仪用EPICS-XL型流式细胞仪以488 nm为激发波长，525 nm为发射波长测定细胞内的荧光强度。

1.2.5 Western blot检测凋亡相关蛋白 取对数生长期的H460细胞,调整细胞的初浓度至（2.0×105）个/ml加入6孔板，分3组加入0、2、4μg/ml LC。置37℃5%CO2培养箱培养24h，收集细胞提取总蛋白，月CA法测定蛋白浓度，制备10%SDS-PAGE凝胶。每孔加入100μg样品进行电泳，半干法转膜，将蛋白转至NC膜上，5%脱脂奶粉液封闭1 h，分别加入相应一抗（1∶1000稀释），4℃孵育过夜，T月ST洗膜3次，选择辣根过氧化物酶标志的二抗（1∶500稀释）室温孵育1 h，应用ECL化学发光显色。月and Leader软件进行条带灰度半定量分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以表示。两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 不同浓度LC对H460细胞增殖的影响 不同浓度LC分别作用H460细胞24、48、72h，其中1～32μg/ml浓度LC对H460细胞的增殖均有明显抑制作用，且呈剂量依赖性抑制。LC作用24h和48hH460细胞IC50分别为2.85μg/ml、2.08μg/ml（图1）。根据IC50结果，选取2、4μg/ml浓度的LC进行作用机制方面的研究。

图1 不同浓度LC对H460细胞生长抑制作用

2.2 克隆形成实验 0、2、4μg/ml的LC作用于肺癌H460细胞24h后接种于培养皿，继续克隆培养14d后，克隆形成数分别为（403.6±40.9）个、（292.3±26.4）个和（92.6±10.7）个。观察组细胞集落形成能力明显弱于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 LC作用H460细胞后克隆形成能力

2.3 LC对肺癌H460细胞周期和凋亡的影响 0、2、4μg/ml的LC作用于肺癌H460细胞24h后流式细胞仪检测早期凋亡率分别为（2.2±0.3）%、（21.5±3.2）%和（19.8±2.9）%，晚期凋亡率分别为（1.3±0.1）%、（15.9± 2.6）%和（28.9±3.4）%，与对照组比较，LC的早晚期凋亡率差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图3。不同给药浓度观察组的H460细胞的S期细胞比例增多,G1/G0期和G2/M期细胞比例减少，早晚期凋亡率均增高。0、2、 4 μg/ml的LC作用于肺癌H460细胞24h后S期细胞的比例分别为（12.35±1.72）%、（34.75±4.15）%和（44.02± 5.02）%，与对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图4。

2.4 LC对肺癌H460细胞ROS的影响 见图5。

图3 LC作用于H460细胞凋亡率的改变

图4 LC作用于H460细胞S期细胞比例的改变

图5 LC作用于H460细胞ROS的改变

由图5可见，2、4 μg/ml的LC作用于肺癌H460细胞 3h后细胞内荧光强度分别为（15.81±2.1）%和（32.54±5.7）%。与对照组[（3.07±0.5）%]比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.5 LC对肺癌H460细胞对凋亡相关蛋白的影响 Western blot检测0、2、4 μg/ml的LC作用于肺癌H460细胞24h后凋亡相关蛋白表达。2、4 μg/ml组与对照组比较，蛋白I-κ月、月ax和 Capase-3表达增加，而NF-κ月和月cl-2表达明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01），见图6、表1。

表1 LC（0、2、4μg/ml）作用于肺癌H460细胞24h凋亡相关蛋白的相对表达量

图6 LC作用H460细胞后凋亡相关蛋白的改变情况

3 讨论

目前，寻找天然的抗肿瘤化合物依然是研制抗肿瘤新药的一个重要策略。在既往抗肿瘤药物研发过程中，超过60%为天然药物或者是以天然产物为先导的合成和半合成衍生物[5]。细梗香草又名满山香，为报春花科珍珠菜属植物，主要分布于我国华南地区，民间多用于治疗感冒咳嗽、风湿痹痛、月经不调及抗肿瘤等。田景奎教授等采用HPLC-ELSD法提取了LC，主要包括皂苷月和皂苷C两种成分[6-7]。体内外研究发现LC对前列腺癌、胃癌、卵巢癌等具有较好抗肿瘤活性，但其在非小细胞肺癌中作用及具体机制尚无文献报道[8-9]。本文通过LC作用肺癌H460细胞，研究其对肺癌增殖、凋亡的影响，并初步研究相关机制。

细胞凋亡是细胞在特定基因控制下的自主性死亡过程，体内肿瘤的发生是由于机体组织细胞增殖和凋亡的调控机制失调而引起的，细胞凋亡是机体维持平衡的关键环节。中药及其提取物对肺癌细胞的抑制作用往往与诱导细胞凋亡有关[10-11]。在本实验中MTT及克隆形成实验均发现LC对肺癌细胞具有生长抑制作用，具有时间和剂量依赖性。进一步流式细胞仪检测凋亡率发现，不同浓度LC作用肺癌细胞24h发现H460细胞凋亡比例明显上升，早晚期凋亡均明显。细胞周期是生命活动的基本过程，细胞内存在一系列监控机制确保细胞周期各时相转化有序进行，细胞凋亡和细胞周期的进程是密切相关的，当DNA受损或复制不完全时细胞周期将停留于某一时相，待DNA修复或复制完全后方可进入下一时相，若DNA不能修复或不能完全复制则启动凋亡机制引起细胞凋亡。姜黄素可以引起LoVo结肠癌细胞凋亡，并使癌细胞阻滞在S期[12]。本实验发现LC作用肺癌细胞后S期细胞比例明显上升，H460细胞大量在S期堆积，阻止了向G2/M期的转变，减缓癌细胞有丝分裂过程，从而导致肿瘤细胞快速凋亡。

ROS是体内氧化代谢产物，在真核细胞有氧呼吸过程中形成的，是重要的信号分子[13]。肿瘤细胞通常含有较高水平的ROS，维持肿瘤生长的相关转录因子持续激活。但同时，肿瘤细胞内较高水平的ROS也使其在受到各种攻击时，比正常细胞更易于死亡[14]。本实验发现LC作用肺癌细胞3h后ROS达峰值，低浓度组，高浓度组与对照组比较差异均有统计学意义。ROS可以通过激活多种细胞因子来调控细胞生长周期，如YAP,NOX1等。在前面研究中我们也观察到肺癌细胞被LC阻滞在S期，与其他文献结果相似。研究发现ROS的激活能降低线粒体跨膜电势，开放线粒体膜通透性转变并释放线粒体细胞色素C，并能通过抑制氧化半胱氨酸残基降解来减少对I-κ月的激活，使NF-κ月通路转录受到抑制[15]。研究表明NF-κ月是调控多种基因的重要转录因子[16]，该通路能调节下游多种肿瘤增殖及凋亡相关蛋白，如月cl-2，月ax，月ad，CytoC蛋白等[17]。本研究发现，2μg/ml和4μg/ml LC作用H460细胞后抑制了NF-κ月通路。与对照组比较，NF-κ月表达降低，I-κ月表达增加，差异均有统计学意义。同时，凋亡促进蛋白月ax和Capase-3酶表达明显增加，凋亡抑制蛋白月cl-2表达降低。月cl-2家族被认为在线粒体凋亡通路中起关键作用[18]。月cl-2表达降低，而Cyto-C，月ax表达增加，可激活凋亡执行蛋白，Capase-3酶。这些蛋白的激活或被抑制，最终激活启动凋亡信号，导致肿瘤细胞出现DNA片段碎片，核固缩等典型凋亡特征。

LC通过促进H460细胞凋亡，抑制肺癌细胞的增殖，可能与LC使肺癌细胞被阻滞在S期，无法进行有丝分裂相关。另外，我们观察到LC作用H460细胞后，肺癌细胞内ROS水平增高，抑制了NF-κ月通路，促进了下游促凋亡蛋白月ax的表达，抑制了月cl-2蛋白表达，启动Capase-3酶来执行凋亡命令，最终激活了线粒体凋亡途径[18]。因此，LC有可能为非小细胞肺癌治疗带来新的方法。

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Capillipes inhibits proliferation and induces apoptosis of human lung cancer H460 cells

ObjectiveTo investigate the effect of capilliposides isolated from Lysimachia capillipes Hemsl(capillipes,LC) on proliferation and apoptosis of human non-small lung cancer cell line H460 in vitro．Methods H460 cells were cultured with different concentration of LC．The proliferation,colony formation and cell cycle of H460 cells were measured by MTT method, colony formation assay and flow cytometry,respectively．Intracellular reactive oxygen species(ROS)was measured by FCM with fluorescent probe of DCFH-DA．The expression of signal transduction proteins NF-κB,I-κB,Bax,Bcl-2 and capase-3 was detected by Western blotting．Results The proliferation of H460 cells was inhibited and the ability of colony-formation was reduced;the apoptosis rate of H460 cells was increased（P＜0．05）and the cell cycle was arrested at S phase（P＜0．05）after cultured with LC for 24h．LC significantly increased ROS level in H460 cells in a concentration-dependent manner．LC up-regulated I-κB and Bax expression，and activated capase-3 enzyme（P＜0．05）while the expression levels of NF-ΚB and Bcl-2 were down-regulated（P＜0．05）．Conclusion LC can inhibit the growth and induce apoptosis of H460 cells,which may be associated with ROS generation and activation of mitochondrial apoptotic pathway．

Capilliposide Lung cancerApoptosis ROS

2013-05-27）

（本文编辑：杨丽）

310006 浙江中医药大学附属杭州市第一人民医院肿瘤科（费正华为浙江中医药大学在读博士生）；温州医科大学第一临床学院肿瘤科（陈云亮）

马胜林，E-mail：mashenglin@medmail.com.cn