多烯紫杉醇脂质核胶束的制备及性质考察

胡凯莉， 贾 娜， 刘 梅， 奉建芳

（上海中医药大学 穆拉德中药现代化研究中心， 上海 201203）

多烯紫杉醇脂质核胶束的制备及性质考察

胡凯莉， 贾 娜， 刘 梅， 奉建芳*

（上海中医药大学 穆拉德中药现代化研究中心， 上海 201203）

目的 采用正交试验优化多烯紫杉醇脂质核胶束的处方工艺并考察其质量。方法 以二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000(PEG-2000DSPE) 为载体材料, 通过薄膜水化法制备载多烯紫杉醇的脂质核胶束。 通过单因素试验和正交试验优化确立了制剂的最优处方工艺。以透射电镜观察载药胶束的外观形态；动态光散射法测定其粒径；HPLC法测定载药量； 以透析法进行体外释放特性考察。 结果 透射电镜下观察多烯紫杉醇脂质核胶束呈外观圆整的球形, 动态光散射法测定其粒径为 (18.3 ±1.8)nm,Zeta电位为 (-17.20 ±6.46)mV, 载药量为 3.1% ～4.1%；体外释放试验表明其具有一定的缓释效应, 体外释放曲线符合 Higuchi方程。 结论 通过处方优化制得的多烯紫杉醇脂质核胶束,具有理想的粒径,载药量和体外释放行为,有望提高多烯紫杉醇的抗肿瘤效果。

多烯紫杉醇；脂质核胶束；正交试验；体外释放

多烯紫杉醇 (Docetaxel,DTX) 是一种半合成的紫杉醇类抗肿瘤药物,其抗肿瘤作用强,临床用于治疗非小细胞肺癌、乳腺癌等,单独及联合用药均有显著 疗 效［1-3］。 但 多 烯 紫 杉 醇 水 溶 性 差, 目 前上市的注射剂以吐温 -80 和乙醇作为溶媒, 临床使用时常出现剧烈的过敏反应,需要联合使用皮质激素［4］, 极大 的 限 制 了 其 进 一 步 应 用。 近 年 来,脂质核胶束 (Lipid-coremicelles) 在难溶性抗肿瘤药物的包载和递送中显示出了独特的优势。相对于其它微粒给药系统,脂质核胶束较小的粒径能更有效的通过 EPR效应在肿瘤部位聚集。此外它还具有更好的稳定性,且制备材料合成简单,安全性好, 已有商业化的商品［5-6］。 本实验通过薄 膜水化法制备多烯紫杉醇脂质核胶束,考察处方工艺因素对于制得胶束粒径及载药量的影响,采用正交试验设计进行处方工艺优化,并对优化处方制得脂质核胶束的体外释放行为进行考察,期望后期能通过注射给药提高多烯紫杉醇的抗肿瘤效果。

1 仪器与材料

Shimadzu LC-20AD高 效 液 相 色 谱 系 统 ( 日 本岛津公司) ； C18色 谱 柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm (大连依 利 特 公 司)； Centrifuge 580R 低 温 离 心 机( 德 国 Eppendorf公 司)； XW-80A 型 涡 旋 混 合 器(上海精科实业有限公司)； JEM-1230 透射电子显微镜 (日本 Joel公司)； AL204 电子天平 (梅特勒-托利多仪器有 限 公司)； RE-200 旋转蒸 发 仪 ( 上海亚荣生物仪器厂)； XW-80A型涡旋混合器 (上海精科 实业有 限公司)；85-2 型 恒温磁 力搅拌器(上 海 梅 颖 浦 公 司) ； Zetasizer Nano粒 度 测 定 仪(英国马尔文公司)； THZ-C恒温振荡器 (太仓市实验设备厂)；MODULYOD-230 冷冻干燥机 (美国Thermo公司)； 多烯紫杉醇 (DTX, 上海天伟生物制药有限公司, 纯度 99.7%, 批号 090501)； 二硬脂 酰 基 磷 脂 酰 乙 醇 胺-聚 乙 二 醇 2000(DPSEPEG2000, 日 本 Nippon Fine Chemical公 司)Tween 80、甲醇等 (国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯, 韩国 SK Chemical公司)； 水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 脂质核胶束的制备 采用薄膜水化法制备载多烯紫杉醇的 PEG-DSPE脂质核胶束 (DTX-M),将含1 mg多 烯 紫 杉 醇 甲 醇 溶 液 加 入 溶 解 有 15 mg PEG-DSPE的氯仿中混匀,38 ℃旋转蒸发成膜。 冷冻干燥 12 h 除 去 痕 量 溶 剂［7］。 加 入 2 m L pH 7.4 HEPES 缓冲液水化。 产物用 0.2 μm的微孔滤膜过滤,即得。

2.2 脂质核胶束的处方工艺优化

2.2.1 单因素试验 以制得多烯紫杉醇-M的粒径和载药量为指标,分别考察制备过程中多烯紫杉醇和 PEG-DSPE的质量比, 成膜时间, 成膜温度,冻干时间,水化介质体积和漩涡时间等因素对于多烯紫杉醇-M制备的影响。 各因素水平见表 1, 结果见图1。

表1 单因素试验的因素及水平Tab.1 Factors and levels of single factor test

由图 1 中可以看出, 除了漩涡时间为 5 min 时制得多烯紫杉醇-M粒径较大, 其余各因素对于多烯紫杉醇-M粒径均无明显影响, 胶束粒径均在18 nm左右。而各因素对于制得多烯紫杉醇-M的载药量均有一定的影响。结合文献,考虑漩涡时间为10 min, 成膜温度 为 38 ℃时胶束 的 载 药量和粒径均最好, 因此确定漩涡时间为 10min, 成膜温度为38 ℃, 选取 DTX和 PEG-DSPE的质量比, 成膜时间,冻干时间和水化介质的体积四个因素进一步通过正交试验设计进行处方优化。

2.2.2 正交试验 以制得多烯紫杉醇-M的粒径分布15 ～25 nm粒径范围粒子所占百分比、 包封产率及载药量为指标, 选择多烯紫杉醇和 PEG-DSPE的质量比 (A), 成膜时间 (B), 冻干时间 (C) 及水化介质的体积 (D) 四个因素, 按照L9(34)正交设计表进行试验。 正交试验因素水平见表2。 正交试验设计及结果见表3。 采用综合评分法, 以载药量和包封产率的最大值分别为 10 分, 粒径分布100%为 10 分, 三项指标之和为综合评分。 应用SPSS 软件对评分实验数据进行方差分析结果见表4。

图 1 各因素对于多烯紫杉醇-M 粒径及载药量的影响 （n=3）Fig.1 Effects of different factors on the particle size and drug load of DTX-M （n=3）

表2 正交试验的因素与水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal design

方差分析结果显示,各因素作用主次为D＞A＞C＞B。 水化介质的体积 (D) 对于胶束粒径,载药量和包封产率有极显著影响 (P＜0.01)。 多烯紫杉醇和 PEG-DSPE的质量比 (A) 及冻干时间(C) 对于胶束粒径, 载药量和包封产率也有显著影响 (P＜0.05)。 而成膜时间 (B) 对于多烯紫杉醇-M的影响不大。 最终确定优化水平组合应为A1B1C2D2, 即 多 烯 紫 杉 醇 和 PEG-DSPE的 质 量 比1 ∶15, 成膜时 间 30 min, 冻 干 时 间 12 h, 水 化 介质的体积2 m L。

表 3 正交实验设计及结果 （n=3）Tab.3 Results of orthogonal design（ n=3）

表4 方差分析结果Tab.4 Results of analysis of variance

2.3 多烯紫杉醇-M的表征 按照优化得到的处方和工艺, 制备 3 批多烯紫杉醇-M, 进行表征。

2.3.1 粒径和表面电荷 采用 Zetasizer Nano粒度测定仪以动态光散射法测定制得胶束的粒径和 Zeta电位。 测 定 条 件:10 mW He-Ne Laser(633 nm),散 射 角 度 为 90°,20℃。 测 得 其 平 均 粒 径 为(18.3 ±1.8)nm, 粒度分布为 (73.3 ±7.1)%, Zeta电位为 (-17.20 ±6.46)mV。

2.3.2 包封产率和载药量 取多烯紫杉醇-M溶液适量, 乙腈溶解后采用 HPLC测定胶束中 DTX的含量,以下式计算载药量及包封产率。

色谱条件: 色谱柱 依 利 特 C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)； 流动相乙腈-水 (50 ∶50), 体积流量1.0 mL/min； 检 测 波长 230 nm； 柱 温 30 ℃； 进 样量 10 μL。 该 方法在 0.02 ～5 μg/m L质量浓度 范 围内线 性 关 系 良 好, 线 性 方 程 为 A=22 416C+ 707.82(R2=0.999 8), 回 收 率 在 98.4% ～101.9%之间, 日内日间精密度 (n=5) 均 ＜2%,专属性符合要求。 计算得到 DTX-M的包封产率为(54.4 ±0.08)%, 载药量为 (3.6 ±0.5)%。

2.3.3 透射电镜观察 将多烯紫杉醇-M加水稀释到适当浓度后滴到碳铜膜网上, 加3%磷钨酸溶液负染,用滤纸吸干溶剂,置于透射电镜下观察形态并拍照, 结果见图2。 可见多烯紫杉醇为形态均匀的球形粒子。

2.4 多烯紫杉醇-M的体外释放试验 采用透析法进行上述优化后处方制备多烯紫杉醇-M的体外释放研 究 。将 制 剂 分 散 于 pH 7.4 PBS 溶 液 中 至 多 烯紫杉醇质 量 浓度为 25 μg/mL, 取 1 mL置于截留分子量为12 000 的 透 析 袋 中 扎 紧, 另 取 1 mL, 加 入0.2 mL空 白 血 浆, 于截 留 分 子 量 为 12 000 的 透 析袋中扎 紧, 透 析 袋 分 别 放 置 在 100 mL含 0.1% W/V吐 温 80(以 达 到 漏 槽 条 件)pH 7.4 PBS 溶 液中, 置于恒温振荡器 中 37 ℃,50 r/min 条件下孵育。 在设定时间点 (0.5、1、 2、 3、4、 6、 8、12 h) 取样, 每次取出 2 mL, 并补充 2mL新鲜介质。平行操作 3 份。 用 HPLC测定不同时间释放介质中多烯紫杉醇的含量,计算累计释放百分率。多烯紫杉醇-M的体外释放结果如图 3 所示。

图 2 多烯紫杉醇-M 透射电镜照片Fig.2 TEM photograph of DTX-M

图 3 多烯紫杉醇-M 的体外释放曲线 （n=3）Fig.3 In vitro release profile of DTX-M （ n=3）

多烯紫杉醇-M在 PBS 缓冲液中约 4 h 释放完全。 在血浆中多烯紫杉醇-M的释放变缓, 约在8 h释放完全,具有一定的缓释效应。对多烯紫杉醇-M在 PBS 缓冲液和血浆中的释放曲线进行模型拟合, 结果见表 5。 多烯紫杉醇-M在 PBS 缓冲液及血浆中的释放均符合 Higuchi方程。

表 5 多烯紫杉醇-M 的释药模型拟合Tab.5 Fitting of releasemodel of DTX-M

4 讨论

众多抗肿瘤药物,如紫杉醇、多烯紫杉醇以及阿霉素等在临床应用中由于水溶性差而严重影响疗效,提高这些药物的水溶性已成为药剂学研究的热点。近年来,脂质体、微球、纳米粒以及聚合物胶束等制剂 方 法 被 广 泛 用 于 疏 水 性 药 物 的 增 溶［8-10］。两亲性嵌段共聚物胶束作为药物载体由于能够实现增溶药物、延长药物半衰期以及增强肿瘤细胞的被动靶向性等优势而成为疏水性抗肿瘤药物最有前景的给药系统［11］。脂质核胶 束 是 由 脂 质 材 料 作 为 胶束内核的一种新型胶束,具有众多优点,比如核的疏水作用强,稳定性好,对亲脂性药物的载药量高, 适宜用作静脉给药［6］； 粒径小,EPR效应和被动靶向作 用 强［5］； 临 界 胶 束 浓 度 低, 体 内 给 药后稀释稳定性好；制备材料合成简单,易于规模化商业化。因此本实验尝试制备多烯紫杉醇的脂质核胶束,以降低现有制剂的副作用,提高其抗肿瘤效果。

本实验通过薄膜水化法成功制备了载难溶性抗肿瘤药物多烯紫杉醇的脂质核胶束,胶束材料PEG-DSPE由亲水性的 PEG链和亲脂性的 DSPE链组成, 在有机溶剂挥发后, 形成透明的药物-聚合物混合物基质,使药物分子和聚合物链交缠在一起。 加入水化介质后,PEG链通过氢键与水分子结合,DSPE链段和亲脂性的多烯紫杉醇远离水溶液形成胶束的内核, 形成核-壳结构的胶束。 PEG链可以保护胶束系统和其中的药物被机体免疫系统识别, 起到长循环的作用, 而成核的 DSPE, 可以被哺乳动物分泌的磷脂酶A2降解, 具有较好的生物可降 解 性［12］。此 外,PEG-DSPE的 临 界 胶 束 浓度很低, 为 1 ×10-6mol/L［13］, 这使 其 在体内具有更好的稳定性。

在正交试验设计过程中选取粒径分布,载药量和包封产率3个指标通过综合评分法进行评价处方的优劣。这是考虑到三者对胶束的体内行为和抗肿瘤效果均有较大影响。胶束的粒径分布直接影响到胶束通过 EPR效应富集于肿瘤组织的能力。 而载药量越高,制剂的给药剂量可以越小,安全性会越好。包封产率则关系到制剂过程中原料的损失也直接影响制剂的成本。这些都是制剂开发过程中需要考虑的因素。 试验中我们发现, 随着 20 nm左右胶束粒度分布的降低,载药量有所升高,这可能是因为胶束中大粒子增多,而粒径较大的粒子包载药物较多所致。 文献报道,10 ～20 nm的胶束能够 最大程度渗透入并蓄 积 在 肿 瘤 组 织［14］, 粒 径 较 大 粒 子载药量虽高,但在体内肿瘤渗透效应较差,不利于胶束抗肿瘤作用的发挥,因此,在处方优化的过程中,我们在考察载药量的同时,还以粒度分布来控制大粒子的百分含量,使优化后的胶束达到更好的体内抗肿瘤效果。 最终制得的胶束粒径 70%以上在 20 nm左右, 有利 于提高 其体内的 EPR效应和抗肿瘤效果。

优化后处方制得多烯紫杉醇脂质核胶束形态圆整, 粒 径 较 小, 具 有 较 理 想 的 载 药 量 (3.6 ± 0.5)%。 体外释放试验结果表明其具有一定的缓释效应, 在 PBS 缓冲液和血浆中的释放均符合Higuchi方 程。 多 烯 紫 杉 醇 血 浆 蛋 白 结 合 率 高( ＞90%) 可能是导致血浆中释放减缓的原因之一［15］。后续试验将进一步 进 行 该 制 剂 抗 肿 瘤 效 果的体内外评价。

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Preparation and characterization of docetaxel-loaded lipid-core m icelles

HU Kai-li, JIA Na, LIU Mei, FENG Jian-fang*

(Murad Research Center for Modermized Chinese Medicine,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai201203,China)

AIM To optimize the preparation of docetaxel-loaded PEG-DSPE lipid-coremicelles with orthogonal design and study the characteristics of the optimizedmicelles.METHODS The docetaxel-loaded PEG-DSPE lipid-coremicelleswere prepared by the thin-film hydration procedure using PEG-DSPE as the carriermaterial.The optimal formulation was verified by single factor experiment and orthogonal design.Themorphologic features of the micelleswere examined by transmission electron microscopy.The particle size and Zeta potential of the micelles were determined by dynamic light scatteringmethod.The docetaxel loads were detected by HPLC.The in vitro release property wasmeasured by dialysismethod.RESULTS The sphericalmicelleswere found to bewith a particle size of(18.3 ± 1.8)nm and a Zeta potential of(-17.20 ±6.46)mV.The drug loading capacity was 3.1% ～4.1%.The in vitro release results showed themicelles had a controlled release property,and the release profile was in line with the Higuchi equation.CONCLUSION The optimized docetaxel-loaded PEG-DSPE lipid-coremicelles,with ideal particle size,drug loading capacity and release properties,may improve the antitumor efficacy of docetaxel.

docetaxel； lipid-coremicelles； orthogonal design； in vitro release

R944.9

:A

:1001-1528(2014)06-1181-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.015

2013-10-15

上海市科学技术委员会纳米专项项目 (11nm0506700)； 上海高校青年教师培养资助计划 (shzy004)

胡凯莉 (1982—), 女, 副研究员, 博士, 主要从事纳米及靶向给药系统的研究。 Tel:(021)51322534,E-mail:Kaili-hu@ 163.com

*通信作者: 奉建 芳 (1966—), 博 士, 研 究 员, 从 事 中 药 新 剂 型 与 新 制 剂 的 研 究。 Tel:(021)51322046； Fax:(021)51322531, E-mail:fengjianfang@vip.163.com