槐定碱 对骨癌痛 大鼠脊髓 NR2B mRNA和 nNOSmRNA表达的影响

严继贵， 王迎新， 杨宇清， 王雅洁

（安徽医学高等专科学校药学系， 安徽 合肥 230601）

槐定碱 对骨癌痛 大鼠脊髓 NR2B mRNA和 nNOSmRNA表达的影响

严继贵， 王迎新， 杨宇清， 王雅洁

（安徽医学高等专科学校药学系， 安徽 合肥 230601）

目的 观察槐定碱对骨癌痛大鼠脊髓 N-甲基-D-天门冬氨酸 (NMDA) 受体亚型 NR2B mRNA和神经元型一氧化氮合酶 (nNOS)mRNA表达的影响, 探讨其抗癌痛的作用机制。 方法 将 W256 癌细胞注入 40 只 SD雌性大鼠骨髓腔复制 骨 癌痛模型 后 随机分为 槐 定碱治疗 组 (腹 腔 注射槐定 碱 25 mg/kg) 及 模 型对 照 组, 另 取 10 只 大 鼠骨 髓 腔 注 入生理盐水, 治疗前后 分 别测量大鼠 热 痛阈和机 械 痛阈； 采用逆 转 录 PCR(RT-PCR) 检 测 大鼠脊髓 NR2B mRNA和nNOSmRNA的表达。 结果 槐定碱能够明显提高 W256 癌细胞诱导的骨癌痛大鼠热痛阈和机械痛阈, 明显下调骨癌痛大鼠脊髓组织 NR2B mRNA和 nNOSmRNA的表达。 结论 槐定碱抗骨癌痛作用可能与下调脊髓与痛觉过敏密切相关的 NMDAR-nNOS/NO-cGMP信号转导通路有关。

槐定碱； 骨癌痛； N-甲基-D-天门冬氨酸受体 2B亚基； 神经元型一氧化氮合酶

槐定 碱 (C15H24N2O, 相 对 分 子 质 量 248.36)是一种从豆科槐属植物苦豆子中提取分离的高效低毒单体生物碱,相关研究结果表明,该生物碱具有明显的 镇 痛 、 抗 肿 瘤、 抗 炎 等 多 种 药 理 活 性［1-3］。现临床上使用的 “盐酸槐定碱注射液” 为该生物碱已开发的制剂,但仅试用于抗恶性滋养细胞肿瘤,其他适应症有待于进一步开发。本课题组采用W256 癌细胞诱导的骨癌痛大鼠模型代替传统的疼痛模型,对槐定碱的抗癌痛作用进行了初步药效评价和外周作用机制探讨,研究结果显示,槐定碱可明显提高骨癌痛大鼠的机械痛阈和热痛阈,并能改善肿瘤引起的骨损伤,抑制肿瘤的发展,具有明显的抗癌痛作用；其抗癌痛作用的外周机制可能与下调肿瘤组织环 氧 酶-2(COX-2) 、 血 管 内 皮生 长 因子 (VEGF) 的表达有关［4］。 本研究旨在探讨槐定碱抗癌痛的中枢作用机制,为该生物碱进一步开发提供实验依据。

1 材料

1.1 药品与试剂 槐定碱 (购自南京景竹生物科技有限公司, 批号 120306, 纯度≥98%)；戊巴比妥钠 (上海化学试剂公司)； 无菌骨蜡 (安徽省第二人民医院提供)； 三氯甲烷 (分析纯, 浙江迪耳药业有限 公司)；Trizol RNA提取 试 剂 盒 (Invitrogen)； 逆 转 录 试 剂 盒 (Promega),RT-PCR 引 物(上海生工生物工程公司合成)； 琼脂糖 (Sigma)。

1.2 实验动物 清洁级雌性 SD大鼠, 体质量 180～200 g。购 自 浙 江 中 医 药 大 学 实 验 动 物 中 心。【SYXK(浙)2012-0013】

1.3 细胞株 W256 癌细胞 (腹水癌细胞种鼠购自浙江医学科学院,经本课题组纯化培养所得)。

1.4 主要仪器 高频乳腺 摄片机 (意大 利产)；C3040-ADUS 型光学显微镜照像系统 (日本 OLYMPUS 公司)； PCR仪 (Techne)； 凝胶成像分析系统(Bio-Rad Gel DocTM EQ170-8060)； ZF-90 型 暗 箱式紫外透射仪 (上海顾村电光仪器厂)； XZC-2B型自控温度热板仪 (山东医学科学院生产)；XZCA型压力测痛仪 (山东医学科学院生产)。

2 方 法

2.1 模型复制与筛选 按照本课题组以往的操作方法［5-6］进 行 骨 癌 痛 模 型 的 复 制: 取 40 只 SD大鼠,3%戊巴比妥钠麻醉后, 用手术刀在左后肢胫骨中上端 切 开皮肤约 1.0 cm, 暴露 胫 骨后, 先用 7号注射器针头穿刺打孔, 再用5μL微量注射器吸取 3 μL约含 4 ×103个癌细胞的 W256 细胞悬 液注入骨髓腔,针孔立即用无菌骨蜡封住,缝合皮肤切口。 手术后的大鼠置笼中常规饲养 10 d 后,3%戊巴比妥钠麻醉,将手术患肢置于高频乳腺摄片机下摄片观察,筛选胫骨中上端骨松质有明显缺损灶的大鼠用作实验。

2.2 动物分组 将复制成功的 36 只模型大鼠随机分为槐定碱治疗组和模型对照组, 每组18只； 另取同期饲养的 10 只大鼠 (骨髓腔注入等体积生理盐水)作为正常对照组。

2.3 动物给药 各组大鼠从手术后第 15 天开始给药。其中,正常对照组和模型对照组腹腔注射生理盐水, 槐定 碱 治 疗 组 给 予 槐 定 碱 水 溶液 25 mg/kg (相当于槐定碱注射液临床推荐最大剂量) 腹腔注射, 每天 1 次, 共给药 10 d。

2.4 标本取材 末次给药后的大鼠在测量热痛阈和机械痛阈后断头处死,立即剪开背部皮肤,分离出脊椎置冰块上,组织钳咬开脊椎骨,暴露脊髓,沿脊髓两侧切断脊神经,完整剥离出腰膨大及以上部 分 约 2.5 cm 脊 髓, 迅 速 截 取 腰 膨 大 上 端 约1.5 cm脊髓投 入 液氮冻存, 每 组随机取 8 个标 本 用于 RT-PCR检测。

2.5 指标检测

2.5.1 痛阈检测 参照文献 ［5］ 所述方法, 各组动物于造模前、给药前及给药末,分别采用热板法和足趾压痛法检测热痛阈及机械痛阈的变化。

2.5.1.1 热痛阈检测 首先将热板仪温度调节至52 ℃ ±0.1 ℃, 然 后将大鼠脚 趾 置 于热板面上,以出现添后足时所需时间 (s) 作为该大鼠的热痛阈值。 每只大鼠均测量 2 次, 间隔时间在 3 min 以上,取2次测量均值作为该大鼠热痛阈值。

2.5.1.2 机械痛阈检测 将大鼠患肢一侧的足掌置于压力测痛仪压力针正下方,开启电动按钮,以大鼠出现缩足或嘶叫为痛反应标志,并将此时测痛仪所示压力值 ( ×10 g) 作为该大 鼠 的 机械 痛 阈值。 每只大鼠均测量 2 次, 时间间隔 3 min 以 上,取2次测量均值作为该大鼠的机械痛阈值。

2.5.2 RT-PCR检 测 NR2B mRNA和 nNOSmRNA表达

2.5.2.1 引物设计: 引物, 由上海生工有限公司根 据 primer 5.0 软 件 设 计 合 成 。 ① NR2B引 物: (上游)5'-TGCACAATTACTCCTCGACG-3',( 下游)5'-TCCGATTCTTCTTCTGAGCC-3', 扩增产物222bp；②nNOS 引物:(上游)5'-GAATACCAGCCTGATCCATGGAA3',(下游)5'-TCCTCCAGGAGGGTGTCCACCGCATG3', 扩增产物602 bp； ③内参 ( β-actin) 引 物: ( 上 游)5'-ACTGCCGCATCCTCTTCCTC 3'； (下 游)5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCACAT 3', 扩增 产 物 480 bp。

2.5.2.2 RT-PCR检测 按照试剂盒说明书所述步骤进行总 RNA提取、 电泳检测提取质量、 定量及逆转录成 cDNA； PCR扩增: 以内参基因 β-actin、 NR2B、 nNOS 的 cDNA为模板, 分别加入扩增反应 体 系 (50 μL):10 ×Reaction Buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2 μL、 上 下 游 引 物(12.5 pmol/μL) 各 1 μL、 cDNA模 板 1 μL、 Taq DNA Polymerase(5 μ/μL)1 μL、 25mmol/LMgCl22 μL, 采用 ddH20 扩 容 至 50 μL, 置 PCR仪 中 扩增。 PCR扩增条件:94 ℃预变性 5 min 后,94 ℃/ 50 s、55.5 ℃ /50 s、 72 ℃ /1min, 反应循环 30 次,最后一轮 72 ℃延伸 5 min,10 ℃保存。

2.5.2.3 结 果 分 析 分 别 取 7 μL的 β-actin 和12 μL NR2B、 nNOS 扩增产物在 1.2%琼脂糖 (含EB 0.5 ng/mL) 上 电 泳 约 35 min,EQ170-8060 凝胶成像分析系统观察并 扫描,PCR条带用 Imagepro plus6.0 图像分析软件进行灰度半定量分析, 分别以 NR2BmRNA和 nNOSmRNA条带与内参 β-actin mRNA条 带 的 积 分 光 密 度 (IOD) 比 值 作 为mRNA的相对表达量。

2.6 统计学处 理 数据采 用 SPSS 11.5 软件进行统计分析, 以 “均数 ±标准差 ()” 表示, 多组间均数比较采用单因素方差分析 (one-way ANOVA), 组间均数比较采用 q检验, 差异显著标准为P＜0.05。

3 结 果

3.1 槐定碱对骨癌痛大鼠痛阈的影响

3.1.1 槐定碱对骨癌痛大鼠热痛阈的影响 与正常组比较, 造模大鼠术后第14天开始热痛阈值显著下降 (P＜0.01), 出现热痛觉超敏, 给予槐定碱治疗后, 大鼠热痛阈值较模型组显著提高 (P＜0.01), 热痛觉超敏明显缓解 (见表 1)。

表1 槐定碱对骨癌痛大鼠热痛阈的影响 （）Tab.1 Effect of sophoridine on pain thresholds of therm al stim ulation of rats w ith bone cancer pain induced by W 256 cancer cells（）

表1 槐定碱对骨癌痛大鼠热痛阈的影响 （）Tab.1 Effect of sophoridine on pain thresholds of therm al stim ulation of rats w ith bone cancer pain induced by W 256 cancer cells（）

注: 与正常组比较,*P＜0.01； 与模型组比较,△P＜0.01

组 别 动物数/只 基础 痛阈/s 术后 14 d/s (治疗前)术 后 25 d/s (治疗末) 10 19.1 ±3.8 18.6 ±3.4 19.4 ±4.8模型组 18 18.8 ±2.5 11.8 ±3.8* 10.3 ±5.2*槐定碱组 18 18.9 ±3.6 12.2 ±4.1* 17.8 ±5.4正常组△

3.1.2 槐定碱对骨癌痛大鼠机械痛阈的影响 与正常组比较, 造模大鼠术后第 14天开始机械痛阈值显著下降 (P＜0.01), 出现明显机械性痛觉超敏, 经槐定碱治疗10 d后, 机械痛阈值均较模型组明显提高 (P＜0.05), 机械痛觉超敏反应显著改善 (见表 2)。

表2 槐定碱对骨癌痛大鼠机械痛阈压力值的影响 （）Tab.2 Effect of sophoridine on pain thresholds ofm echanical stim ulation of rats w ith bone cancer pain induced by W 256 cancer cells（）

表2 槐定碱对骨癌痛大鼠机械痛阈压力值的影响 （）Tab.2 Effect of sophoridine on pain thresholds ofm echanical stim ulation of rats w ith bone cancer pain induced by W 256 cancer cells（）

注: 与正常组比较,*P＜0.01； 与模型组比较,△P＜0.05

组 别 动物数/只基础痛阈/kg术后 14 d/kg (治疗前)术 后 25 d/kg (治疗末) 10 0.301 ±0.037 0.315 ±0.043 0.319 ±0.049模型组 18 0.297 ±0.032 0.258 ±0.041*0.214 ±0.035*槐定碱组 18 0.306 ±0.029 0.261 ±0.046*0.289 ±0.041正常组△

3.2 槐 定 碱 对 骨 癌 痛 大 鼠 脊 髓 NR2B mRNA和nNOSmRNA表达的影响 与正常对照组比较, 模型对照组大鼠脊 髓组织 NR2B mRNA和 nNOSmRNA相对表达量均有明显升高 (P＜0.05)； 与模型对照组比较, 槐定碱治疗组大鼠脊髓组织 NR2B mRNA和 nNOS mRNA相 对 表 达 量 均 明 显 下 调(P＜0.05)。 见表 3 及图 1、 图 2。

表3 槐 定 碱 对 骨 癌 痛 大 鼠 脊 髓 NR2B m RNA和 nNOS m RNA表达的影响 （）Tab.3 Effects of sophoridine on on the expression of NR2B m RNA and nNOSm RNA in sp inal cord of ratsw ith bone cancer pain（）

表3 槐 定 碱 对 骨 癌 痛 大 鼠 脊 髓 NR2B m RNA和 nNOS m RNA表达的影响 （）Tab.3 Effects of sophoridine on on the expression of NR2B m RNA and nNOSm RNA in sp inal cord of ratsw ith bone cancer pain（）

注: 与正常对照组比较,*P＜0.05； 与模型对照组比较,△P＜0.05

mRNA表达相对值组 别 给药剂量 样本数NR2B nNOS正常对照组- 8 0.971 ±0.067 1.015 ±0.054模型对照组 - 8 1.325 ±0.024*1.352 ±0.085*槐定碱治疗组 25 mg/kg 8 0.915 ±0.087△0.912 ±0.078△

图 1 NR2B m RNA和 β-actin m RNA RT-PCR扩增 产 物Fig.1 Amplification products of NR2BmRNA andβ-actin m RNA

4 讨 论

图 2 β-actinm RNA和 nNOSm RNA RT-PCR扩 增 产物Fig.2 Am p lification products of β-actin m RNA and nNOSm RNA

研究表明,癌症痛的发生与传统的炎性痛和神经病理性疼痛有相似之处,但又有独特的发生发展机制［7］。 因而, 采 用 传 统 疼 痛 模 型 对 抗 癌 痛 药 物进行评价和研究存在明显的局限性。本实验采用来源于大鼠乳腺癌组织,具有良好骨侵袭能力的W 256 癌细胞注入大鼠骨髓腔, 成功建立了 骨癌痛模型［8］, 采用 该模型代替 传 统 疼痛 模 型 对抗 癌 痛药物进行研究,更加符合临床实际,研究结果更为可靠。

大量证据显示,NMDA受体与脊髓水平伤害性信息的处理以及痛觉过敏的形成和维持密切相关,该受体的表达和激活在病理性痛的产生和维持中发挥着重要作用［9］。目前已知 NMDA受体至少存在 7个亚 基, 包 括 1 个 NR1 亚 基、 4 个 NR2 亚 基(NR2A、 NR2B、 NR2C、 NR2D) 及 2 个 NR3 亚基(NR3A、 NR3B)［10］。 其 中,NR2B亚 基 主 要 分 布于与疼痛传导密切相关的脊髓背角Ⅰ、Ⅱ层和前脑。 行为学研究发现, 正常动物鞘内注射 NMDA可引起自发伤害性感受行为,并诱发动物产生热痛觉和机械性痛觉过敏； 应用选择性作用于 NR2B亚基的 NMDA受体拮抗剂可有效缓解大鼠慢性炎症和神经损伤模型中的热痛觉过敏和机械性触诱发痛。 这些结果表明,NR2B亚基在突触传递、 痛觉感知和中枢痛觉敏化形成等方面发挥了重要的作用, 也间接表明 NR2B亚基可能是药物镇痛的新靶点［11-12］ 。

一氧化氮 (NO) 是一种具有极强生物活性的无机小分子,也是一种新型的神经递质,在体内可强化神经系统的信息传递,介导多种神经生理和病理过程,尤其在痛觉信号传导过程中起重要作用。NO水平的变化主要取决于一氧化氮合酶 (NOS)的表达水平及活力, 它是生成 NO的限速酶。NOS有三种亚型, 分别是诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)、 神经元型一氧化氮合酶 (nNOS) 和内皮型一氧化氮合酶 (eNOS), 其中 nNOS 是 NO在神经系统中生成的关键酶。研究发现,坐骨神经慢性束缚损伤模型大鼠中脊髓背角 nNOS 活性显著增加；皮下注入福尔马林前, 先向髓腔内注入 nNOS 抑制药, 疼痛行为产生明显减弱, 表明 nNOS/NO在神经病理性性疼痛和炎性痛的形成中发挥重要作用［13］。一般情况下, 神 经 系统 中 NO的 产生 依 赖于 NMDA受体的激活,NMDA受体激活后可以激活 nNOS, 后者可催化 L-精氨酸和氧生成 NO,NO作为鸟苷酸环化酶 (GC) 的内源性因子, 促进环鸟苷酸 (cGMP) 的合成, 提高靶细胞内的 cGMP水 平, 形 成 NMDAR-nNOS/NO-cGMP信 号 转 导 通路,该通路在疼痛调节和痛觉过敏中发挥着重要作用［14］。

本研究结果表明,槐定碱能够显著提高骨癌痛模型大鼠的热痛阈和机械性痛阈值 (P＜0.01, P＜0.05), 明显改善 W 256 癌细胞诱 导 的骨癌痛大鼠痛觉过敏状态,呈现出较好的抗癌痛作用。对大鼠脊髓 NR2B mRNA和 nNOSmRNA表达检测结果显示, 模型组大鼠较正常对照组大鼠脊髓组织NMDA受体 NR2B亚基和神经元型一氧化氮合酶 nNOS的 mRNA表达量均有明显升高 (P＜0.05), 而经槐定碱治疗后脊髓组织 NR2B和 nNOSmRNA表达量均明显下调 (P＜0.05), 表明采用 W256 癌细胞诱导的骨癌痛模型的痛觉敏化形成可能与NMDAR-nNOS/NO-cGMP信 号 转 导 通 路 的 激 活 有关。而槐定碱抗骨癌痛作用的机制可能与抑制该信号转导通路有关。槐定碱可能是通过下调脊髓NR2B亚基的mRNA表达, 抑制 NMDA受体的表达和激活, 继而使 nNOS 的表达和 NO的生成减少,最终抑制了肿瘤引起的中枢痛觉过敏的形成。

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Effects of sophoridine on expression of NR2B m RNA and nNOSm RNA in spinal cord of rats w ith bone cancer pain

YAN Ji-gui, WANG Ying-xin, YANG Yu-qing, WANG Ya-jie

(Department of Pharmacy,AnhuiMedical College,Hefei 230601,China)

AIM To explore the effects ofsophoridine onmRNA expression of N-methyl-D-aspartate(NMDA) receptor NR2B subunit and neuronal nitric oxide synthase(nNOS)in spinal cord of ratswith bone cancer pain induced by W256 tumor cells,and their analgesic mechanism.METHODS Forty female Sprague-Dawley rats were used asmodels of bone cancer pain after being injected with W256 tumor cells into the marrow cavity,random ly divided into two groups:sophoridine treated group(25mg/kg sophoridine)andmodel controlgroup.Another ten ratswere selected to be normal control group by injecting normal saline.Before and after the treatment,pain thresholds of thermal stimulation and mechanical stimulation weremeasured.After the treatment,the expression of NR2BmRNA and nNOSmRNA in spinal cord were detected by RT-PCR.RESULTS Sophoridine could obviously increase the thresholds of thermal stimulation and mechanical stimulation in rats with bone cancer pain induced by W256 tumor cells.And it could significantly downregulate the expression of NR2B mRNA and nNOSmRNA in spinal cord of rats with bone cancer pain.CONCLUSION The analgesicmechanism of sophoridine against bone cancer pain may be related to its downregulation of the signal transduction pathway of“NMDAR-nNOS/NO-cGMP”which is closely connected with hyperalgesia.

sophoridine； bone cancer pain； N-methyl-D-aspartate receptor2B subunit(NR2B) ； neuronal nitric oxide synthase(nNOS)

R966

:A

:1001-1528(2014)06-1142-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.007

2013-11-07

安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目 (KJ2012Z203)

严继贵 (1975—), 男, 博士, 副教授, 从事中药抗癌痛及新药研究。 Tel:(0551)63818309,E-mail:yanjigui1210@126.com